产品信息：

• 检测类型：定量检测

• 产品规格：100测试

• 适用样品类型：对各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的Sf9细胞及杆状病毒（AcNPV）DNA进行分析。

• 线性范围：Sf9（3×10-3~3×102pg/μL；R2≥0.990；扩增效率为96.5%），AcNPV（5.14E+01~5.14E+06 copies/μL；R2≥0.990；扩增效率为93.0%）

• 样品回收率：50-150%

• LLOQ：Sf9（1.50×10-3pg/μL），AcNPV（5.14E+01 copies/μL）

• 专属性：不受CHO、293T、HEK293、Vero、毕赤酵母、NS0等常见工程细胞基因组DNA的干扰。

• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在15%以内。

• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96、博日FQD-96A、Roche LightCycler480、耶拿qTOWER3G

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：定量下限低至Sf9（1.50×10-3pg/μL），AcNPV（5.14E+01 copies/μL），满足实际检测需求。

• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善

n  试剂盒简介

SHENTEK® Sf9&AcNPV 残留 DNA 检测试剂盒（多重 PCR-荧光探针法）用于定量检测昆虫细胞（Sf9）杆状病毒表达系统来源的基因工程疫苗中残留的 Sf9 细胞 DNA 和杆状病毒（AcNPV）DNA 的专用试剂盒。

本试剂盒利用 Taqman 探针原理，采用多重 qPCR 的方法定量检测样品中 Sf9 和 AcNPV 残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 50 copies/反应。试剂盒配套有 Sf9&AcNPV 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的 Sf9&AcNPV 微量 DNA。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于诊断。

n  试剂盒组分

n  规格

100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于以下机型，使用前需验证检测灵敏度）

1.  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

2.  7500 Real-Time PCR System

3.  CFX96 定量 PCR 系统

4.  FQD-96A 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

1.  1.5 mL 无菌低吸附离心管

2.  96 孔 qPCR 板或八联管

3.  1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

1.  荧光定量 PCR 仪

2.  1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  实验操作流程

图 1 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.         工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。

3.         将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2~8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

（二）qPCR 反应液准备：

1.        根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=（6 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3

2.        MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。

MIX 总量 =（反应孔数+2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）

3.       qPCR MIX 配制：根据表 2 配制表准备各试剂 qPCR MIX 用量。表 2. qPCR MIX 配制表

二、样品准备

l Sf9&AcNPV DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

定量参考品浓度标注于管壁标签。其中 Sf9 DNA 浓度为 30 ng/μL；AcNPV DNA 浓度为 2 ng/μL，换算成拷贝数为 5.14×108 copies /μL。

将定量参考品快速离心 15 秒，准确移取 55 μLddH2O 加至管底，溶解冻干粉。

为保证冻干粉充分溶解，轻弹数下混匀，短时间快速离心 10 秒，如此重复 3次，再静置 10 分钟后使用。

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行稀释，具体操作如下：

1. 将试剂盒中的Sf9&AcNPV 定量参考品和DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下融化后。轻弹数下混匀，短时间快速离心 3 - 5 秒，如此重复 3 次。

2. 取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5， ST6。

3. 在ST0 管中用DNA 稀释液将 Sf9&AcNPV 定量参考品稀释 10 倍，得到 ST0，振荡混匀后短时间快速离心 3 - 5 秒，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。

5. 按表 3 依次进行 6 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。

*对于 AcNPV DNA，客户可选择拷贝数浓度或质量浓度作为标曲赋值。

l 阴性对照（NCS)

取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。备注：阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

三、操作步骤

（一）加样

1.       各试剂置于冰上，轻微震荡混匀，按表 4 所示加样：

2.       将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 秒后放入qPCR仪。

² 该示例表示的是检测6 个浓度梯度的Sf9&AcNPV 标准曲线（ST1～ST6）、 1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样品（S1～S5）。每个检测做 3 个重复孔。

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

（二）qPCR 程序设置

l  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：

1.         点击“实验向导”，“基本设置”中设置实验信息。

2.         “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3.         选择步骤 2：选择项目中的“Sf9&AcNPV 残留 DNA”程序。

4.         “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

l  其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.  创建新检测探针，命名为 Sf9-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 AcNPV-DNA，选择报告荧光基团为 CY5，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX。

3.    设置两步法反应程序：95℃ 预变性 10 分钟；95℃ 15 秒，60℃ 1 分钟（读取荧光），40 个循环；反应体积 30μL。

四、结果计算与判断

（一）结果计算

l  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例： 1．“孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，例如“通道 1 目 标 Sf9-DNA”中标品赋值设为 300、30、3、0.3、0.03，0.003，“通道 4目标：AcNPV-DNA”中标品赋值设为（以拷贝数浓度为例）5.14×106、5.14×105、5.14×104、5.14×103、5.14×102、5.14×101，并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。

2.   待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.   在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.   在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

l  以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例：

选择 FAM 检测通道代表 Sf9，同样选择 CY5 通道代表 AcNPV。 1．在 Results 的 Amplification Plot 中，将 Threshold 设置为 0.02，点击Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.   在 Results 的 Plate 中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别根据表 2 赋值，例如 Sf9 设为 300、30、3、0.3、 0.03、0.003（单位为 pg /μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。

3.   在Results 的Plate 中，将无模板对照 NTC 孔的Task 一栏设置为NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击。

4.   在 Results 的 Standard Curve 中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.   在 Results 的 Report 中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值。

（二）结果判断

1.   样品的 Ct-IPC 值与 NCS 的 Ct-IPC 值要求在±1 个 Ct 值范围内，如样品的 Ct-IPC 值于 NCS 的 Ct-IPC 值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。建议同时测试加标样品，优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。

2.   阴性质控 NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。

3.    无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35。

结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2023 年 11 月 09 日

生效日期：2023 年 11 月 10 日