本试剂盒用于定量检测昆虫细胞（High Five）-杆状病毒表达系统来源的基因工程疫苗中残留的Hi5细胞DNA和杆状病毒（AcNPV）DNA的专用试剂盒，配套有Hi5&AcNPV定量参考品。
本试剂盒与SHENTEK®宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样本中残留的Hi5&AcNPV微量DNA。
SHENTEK® Hi5&AcNPV 残留 DNA 检测试剂盒（多重 PCR-荧光探针法）用于定量检测昆虫细胞（High Five）杆状病毒表达系统来源的基因工程疫苗中残留的 Hi5 细胞DNA和杆状病毒（AcNPV）DNA 的专用试剂盒。
本试剂盒利用荧光探针原理，采用多重 qPCR 的方法定量检测样品中 Hi5 和 AcNPV残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 50 copies/反应。试剂盒配套有 Hi5&AcNPV 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的 Hi5&AcNPV 微量 DNA。
该试剂盒仅供研究使用，不可用于诊断。
100 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。n 适用机型（包括但不限于以下机型，使用前需验证检测灵敏度）
1. SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统
2. 7500 Real-Time PCR System
3. CFX96 定量 PCR 系统
4. FQD-96A 定量 PCR 系统
1. 1.5 mL 无菌低吸附离心管
2. 96 孔 qPCR 板或八联管
3. 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附有滤芯枪头
1. 荧光定量 PCR 仪
2. 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
图 1 操作流程示意图
1. 穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。
2. 工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。
3. 将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2~8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。
1. 根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3
2. MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。
MIX 总量 =（反应孔数+2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）
3. qPCR MIX 配制：根据表 2 配制表准备各试剂 qPCR MIX 用量。表 2. qPCR MIX 配制表
定量参考品浓度标注于管壁标签。其中 Hi5 DNA 浓度为 30 ng/μL；AcNPV DNA 浓度为 2 ng/μL，换算成拷贝数为 5.14×108 copies /μL。
将定量参考品快速离心 15 秒，准确移取 55 μL ddH2O 加至管底，溶解冻干粉。为保证冻干粉充分溶解，轻弹数下混匀，短时间快速离心 10 秒，如此重复 3次，再静置 10 分钟后使用。
用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行梯度稀释，具体操作如下：
1. 将试剂盒中的Hi5&AcNPV 定量参考品和DNA 稀释液置于冰上或 2-8℃条件下融化。轻弹数下混匀，短时间快速离心 3 - 5 秒，如此重复 3 次。
2. 取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST，ST0，ST1，ST2，ST3，ST4， ST5。
3. 在 ST 管中用 DNA 稀释液将 Hi5&AcNPV DNA 定量参考品稀释 10 倍，得到 ST。振荡混匀后短时间快速离心 3 - 5 秒，重复 3 次以确保定量参考品与DNA稀释液充分混匀。
4. 在 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。
5. 按表 3 依次进行 6 次稀释操作。
已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。
若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。
标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。
*对于 AcNPV DNA，客户可选择拷贝数浓度或质量浓度作为标曲赋值。
1．取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。备注：阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
1. 各试剂置于冰上，轻微震荡混匀，按表 4 所示加样：
² 该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的Hi5&AcNPV DNA 标准曲线（ST1～ ST5）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样品（S1～ S5）。每个检测做 3 个重复孔。
² 实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
2. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 秒后放入qPCR仪。
l SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：
1. 点击“实验向导”，“基本设置”中设置实验信息。
2. “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。
3. 选择步骤 2：选择项目中的“Hi5&AcNPV 残留 DNA”程序。
4. “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
l 其他定量 PCR 系统程序设置如下：
选择 FAM 通道代表 Hi5 DNA 检测信号，选择 CY5 通道代表 AcNPV DNA 检测信号，选择 VIC 通道代表 IPC 检测信号。
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，命名为 Hi5-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 AcNPV-DNA，选择报告荧光基团为 CY5，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。
3. 设置两步法反应程序：95℃ 预变性 10 分钟；95℃ 15 秒，60℃ 1 分钟（读取荧光），40 个循环；反应体积 30μL。
l 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例： 1．“孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，例如“通道 1 目标：Hi5-DNA”中标品赋值设为 30、3、0.3、0.03，0.003，“通道 4
目标：AcNPV-DNA”中标品赋值设为（以拷贝数浓度为例）5.14×105、
5.14×104、5.14×103、5.14×102、5.14×101，并且在相应的“样本名称”
中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
2. 待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。
3. 在“实验分析”页面点击
，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。
4. 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
l 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例：
选择 FAM 检测通道代表 Hi5，同样选择 CY5 通道代表 AcNPV。 1．在 Results 的 Amplification Plot 中，将 Threshold 设置为 0.02，点击
Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在 Results 的 Plate 中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别根据表 2 赋值，例如 Hi5 设为 30、3、0.3、0.03、 0.003（单位为 pg /μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、 ST2、ST3、ST4、ST5。
3. 在Results 的Plate 中，将无模板对照 NTC 孔的Task 一栏设置为NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击
。
4. 在 Results 的 Standard Curve 中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5. 在 Results 的 Report 中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值。
1. 样品的 Ct-IPC 值与 NCS 的 Ct-IPC 值要求在±1 个 Ct 值范围内，如样品的 Ct-IPC 值于 NCS 的 Ct-IPC 值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。建议同时测试加标样品，优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。
2. 阴性质控 NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。
3. 无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
修订日期：2023 年 11 月 09 日
生效日期：2023 年 11 月 10 日
400-829-0116
