SHENTEK® CV-1 残留 DNA 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 CV-1 宿主细胞 DNA 的专用试剂盒。
本试剂盒利用荧光探针原理，定量检测样品中 CV-1 残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 CV-1 DNA 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中 CV-1 残留 DNA。
SHENTEK® CV-1 残留 DNA 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 CV-1 宿主细胞 DNA 的专用试剂盒。
本试剂盒利用荧光探针原理，定量检测样品中 CV-1 残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 CV-1 DNA 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中 CV-1 残留 DNA。
该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。
100 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
n 适用机型（包括但不限于）
1. SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统
2. 7500 Real-Time PCR System
3. CFX96 定量 PCR 系统
4. LineGene 9600plus 定量 PCR 系统
1. 1.5 mL 无菌低吸附离心管
2. qPCR 板或条（与所使用的定量荧光 PCR 仪相适应）
3. 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头
1. 荧光定量 PCR 仪
2. 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
图 1 操作流程示意图
1. 穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。
2. 工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。
3. 将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2-8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。
1．反应孔数计算：根据检测样品的数量，计算所需反应孔数，一般做 3个重复孔/样。
反应孔数=（6 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品×2）×3待测样品×2 是因为我们推荐每个待测样品检测时都应同时做样品ERC。
2．MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。
MIX 总量 =（反应孔数+2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）
3．qPCR MIX 配制：根据表 2 配制表准备各试剂 qPCR MIX 用量。表 2. qPCR MIX 配制表
CV-1 DNA 定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。
用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行稀释，具体操作如下：
1. 将试剂盒中的CV-1 DNA 定量参考品和DNA 稀释液置于冰上或2-8℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 秒，如此重复 3 次。
2. 取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3， ST4，ST5，ST6。
3. 在ST0 管中用 DNA 稀释液将CV-1 DNA 定量参考品稀释至 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 秒，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。
4. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6 管中分别加入 90 μLDNA 稀释液。
5. 按表 3 依次进行 6 次稀释操作。
已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。
若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。
标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。
根据需要设置ERC 中的 CV-1 DNA 加样浓度（以制备加 30 pg CV-1 DNA量的样品 ERC 为例），具体操作如下：
1. 取 100 μL 待测样品加入 1.5 mL 干净的离心管中。
2. 再加入 10 μL ST3，混匀，标记为样品 ERC。
备注：样品ERC 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成样品ERC纯化液。
1. 取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控NCS。
备注：阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
1. 各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，按表 4 和表 5 所示加样：
² 该示例表示的是检测 6 个浓度梯度的 CV-1 DNA 标准曲线（ST1～ST6）、 1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样品（S1～S5）和每个样品的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每个检测做 3 个重复孔。
² 实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
2. 将96 孔板用光学膜封闭，轻微振荡混匀，短时间快速离心10 秒后放入qPCR仪。
l SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：
1. 点击“实验向导”。
2. “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。
3. 选择步骤 2：选择项目中的“CV-1 残留 DNA”程序。
4. “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
l 其他定量 PCR 系统程序设置如下：
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，命名为 CV-1-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。
3. 设置两步法反应程序：95 ℃预变性 10 分钟；95 ℃ 15 秒，60 ℃ 1 分钟（读取荧光），40 个循环；反应体积 30 μL。
l 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例： 1．“孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，“CV-1 残留 DNA”分别设为 300、30、3、0.3、0.03、0.003，并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。
2. 待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。
3. 在“实验分析”页面点击
，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。
4. 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
l 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例：
1. 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在Results 的Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 3000、300、30、3、0.3、0.03（含义为每孔的 DNA 总量，单位为 pg），并且在相应的 sample name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。
3. 在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔、样品 ERC 孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、 S、ERC，之后点击
。
4. 在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5. 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品、样品 ERC 的检测值，单位为 pg/10μL。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μL 或 pg/mL。
1. 根据待测样品和样品 ERC 的检测结果计算加样回收率，加样回收率要求在 50%~150%之间。
2. NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。
3. NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室的机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
修订日期：2023 年 07 月 05 日
生效日期：2023 年 07 月 06 日
400-829-0116
