汉逊酵母残留 DNA 检测试剂盒用于定量检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中汉逊酵母宿主细胞 DNA 的专用试剂盒。
本试剂盒利用 Taqman 探针原理，定量检测样品中汉逊酵母残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 级别。试剂盒配套有汉逊酵母 DNA 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的微量汉逊酵母细胞 DNA。
100 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统
Ø 7500 Real-Time PCR System
Ø StepOne Plus Real-Time PCR System
Ø CFX96 定量 PCR 系统
Ø LineGene 9600 定量 PCR 系统
Ø Mx3000PTM 定量 PCR 系统
Ø 1.5 mL 无菌离心管
Ø 96 孔 qPCR 板
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头
Ø 荧光定量 PCR 仪
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
v 汉逊酵母 DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备
汉逊酵母 DNA 定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。 用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL，30 fg/μL。具体操作如下：
1. 将试剂盒中的 DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3~5 s，如此重复 3 次。
2. 取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。
3. 在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 DNA 定量参考品稀释至 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3~5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。
4. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。
5. 按表 2 依次进行 5 次稀释操作。
已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8℃。
若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37℃条件下进行孵育。
标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。
根据需要设置 ERC 中的汉逊酵母 DNA 加样浓度（以制备加 30 pg 汉逊酵母 DNA量的样品 ERC 为例），具体操作如下：
1. 取 100 μL 待测样品加入 1.5 mL 干净的离心管中。
2. 再加入 10 μL ST3，混匀，标记为样品 ERC。
样品 ERC 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成样品 ERC 纯化液。
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
1. 取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。
阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
1．根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
待测样品×2 是因为我们推荐每个待测样品检测时都应同时做样品 ERC。 2．根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：
3．各试剂放在冰上或 2-8℃条件下融化，并根据表 3 所示准备 qPCR MIX：
1. 各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，按表 4 所示加样：
加样完成后每孔总体积为 30 μL。
该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 DNA 标准曲线（ST1～ST5）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样品（S1～S5）和每个样品的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每个检测做 3 个重复孔。
实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
2. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。
² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. 点击“实验向导”。
2. “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。
3. 选择步骤 2：选择项目中的“汉逊酵母残留 DNA”程序。
4. “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
² 其他定量 PCR 系统程序设置如下：
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。
3. 设置两步法反应程序：95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min（读取荧光）， 40 个循环；反应体积 30 μL。
² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，例如“汉逊酵母残留 DNA”设为 300、30、3、 0.3，0.03，并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
2. 待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。
3. 在“实验分析”页面点击
，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。
4. 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
² 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。
1. 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 3000、300、30、3、0.3（含义为每孔的 DNA 总量，单位为 pg），并且在相应的 sample name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
3. 在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔、样品 ERC 孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 sample name 一栏中命名为 NTC、NCS、S、ERC，之后点击
。
4. 在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5. 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品、样品 ERC 的检测值，单位为 pg/10 μL。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μL 或 pg/mL。
6. 根据待测样品和样品 ERC 的检测结果计算加样回收率，加样回收率要求在 50%~150%之间。
7. 阴性质控 NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。
8. 无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
修订日期：2023 年 01 月 16 日
400-829-0116
