本试剂盒用于定量检测各种生物制品及药品中的中间品、半成品和成品中酿酒酵母宿主细胞DNA的专用试剂盒，与SHENTEK^®宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样本中残留的微量酿酒酵母细胞DNA。

n  试剂盒简介

酿酒酵母残留 DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）用于定量检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中酿酒酵母宿主细胞 DNA 的专用试剂盒。

本试剂盒利用荧光探针原理，定量检测样品中酿酒酵母残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 级别。试剂盒配套有酿酒酵母 DNA 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的微量酿酒酵母细胞 DNA。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。

n  试剂盒组分

n  规格

100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

1.    SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

2.    7500 Real-Time PCR System

3.    StepOne Plus Real-Time PCR System

4.    CFX96 定量 PCR 系统

5.    Linegene 9600 定量 PCR 系统

6.    Mx3000PTM 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

1.  1.5 mL 无菌低吸附离心管

2.  96 孔 qPCR 板

3.  1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  实验操作流程

图 1 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.         工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。

3.         将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2-8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

（二）qPCR 反应液准备：

1.       反应孔数计算：根据检测样品的数量，计算所需反应孔数，一般做 3个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3

2.       MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。

MIX 总量 =（反应孔数+2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）

3.      qPCR MIX 配制：根据表 2 配制表准备各试剂 qPCR MIX 用量。表 2. qPCR MIX 配制表

二、样品准备

l 酿酒酵母 DNA  定量参考品的稀释和标准曲线的制备

酿酒酵母 DNA 定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行稀释，具体操作如下：

1.      将试剂盒中的DNA 定量参考品和DNA 稀释液置于冰上或 2-8℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 秒，如此重复 3 次。

2.      取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3， ST4，ST5。

3.      在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 DNA 定量参考品稀释至 3 ng/ μL，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 秒，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA稀释液充分混匀。

4.      在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。

5.      按表 3 依次进行 5 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

l 加标回收（ERC）

根据需要设置 ERC 中的酿酒酵母 DNA 加样浓度（以制备加 30pg 酿酒酵母 DNA 量的样品 ERC 为例），具体操作如下：

1.      取 100 μL 待测样品加入 1.5 mL 干净的离心管中。

2.      再加入 10 μL ST3，混匀，标记为样品 ERC。

备注：样品ERC 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成样品ERC纯化液。

l 阴性对照（NCS)

1. 取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控NCS。

备注：阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

三、操作步骤

（一）加样

1.        各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，按表 4 和表 5 所示加样：

²  该示例表示的是检测 5个浓度梯度的 DNA 标准曲线（ST1～ST5）、1个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样品（S1～S5）和每个样品的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每个检测做 3 个重复孔。

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.   将96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心10 秒后放入qPCR仪。

（二）qPCR 程序设置

l  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：

1.         点击“实验向导”。

2.         “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3.         选择步骤 2：选择项目中的“酿酒酵母残留 DNA”程序。

4.         “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.  创建新检测探针，命名为 Sac-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。

3.    设置两步法反应程序：

95 ℃预变性 10 分钟；95 ℃ 15 秒，60 ℃ 1 分钟（读取荧光），40 个循环；反应体积 30μL。

四、结果计算与判断

（一）结果计算

·  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例： 

1．“孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 3 赋值，例如“酿酒 酵母残留 DNA”设为 300、30、3、0.3，0.03，并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

2.   待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.   在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.   在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

· 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例：

1.   在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.   在Results 的Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 3000、300、30、3、0.3（含义为每孔的 DNA 总量，单位为 pg），并且在相应的 sample name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

3.   在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔、样品 ERC 孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、 S、ERC，之后点击。

4.   在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.   在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品、样品 ERC 的检测值，单位为 pg/10μL。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μL 或 pg/mL。

（二）结果判断

1.   根据待测样品和样品 ERC 的检测结果计算加样回收率，加样回收率要求在 50%~150%之间。

2.       阴性质控 NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。 

3．无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。

 上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2023 年 07 月 11 日

生效日期：2023 年 07 月 14 日