产品信息：

• 检测类型：定量检测

• 产品规格：100测试

• 适用样品类型：对各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的Human细胞DNA片段大小分布进行分析。

• 线性范围：3×10-2~3×102pg/μL，R2≥0.990；122bp：扩增效率为100.5%；244bp：扩增效率为100.5%；562bp：扩增效率为90.7%

• 样品回收率：50-150%

• LLOQ：3.00×10-2pg/μL

• 专属性：不受CHO、E.coli、毕赤酵母和NS0等常见工程细胞基因组DNA的干扰。

• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在40%以内。

• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96、Roche LightCycler480

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：定量下限低至3.00×10-2pg/μL，满足实际检测需求。

• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。

n  试剂盒简介

SHENTEK® Human 残留 DNA 片段分析检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 Human 宿主细胞 DNA 残留片段大小分布的专用试剂盒。

本试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理，设计了四种不同的扩增片段（75 bp、122 bp、244 bp、562 bp）来定量检测分析样品中 Human 残留 DNA 片段的大小分布情况。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 Human DNA 定量参考品。本试剂盒与宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用。

n  试剂盒组分

n  规格

4×100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

Ø 7500 Real-Time PCR System

Ø CFX96 定量 PCR 系统

Ø LineGene 9600 plus 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 1.5 mL 低吸附无菌离心管

Ø 96 孔 qPCR 板

Ø 封板膜

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

Ø 荧光定量 PCR 仪

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  操作过程

v Human  DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段，在建立标曲时，需分别对不同的扩增片段设置标曲，并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

Human  DNA  定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 Human DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL，30 fg/μL。具体操作如下：

1．将试剂盒中的 Human DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下融化，待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 s，如此重复 3 次。

2.    取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。

3.    在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 Human DNA 定量参考品稀释至 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.    在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 180 μL DNA 稀释液。

5.    按表 2 依次进行 5 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。

v 阴性质控 NCS 的制备

1. 取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。

阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

v qPCR 反应液（qPCR MIX）的准备

1.       根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+1 个无模板对照 NTC+1 个阴性质控 NCS +待测样品）× 3

2.       根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：

qPCR MIX =（反应孔数+2）× 20 μL

3.       各试剂放在冰上或 2-8 ℃条件下融化，并参考表 3、4、5、6 所示准备对应扩增片段的 qPCR MIX：

为满足同步进行四种扩增片段检测，DNA 模板需≥120 μL，建议每个样品同时准备 2 管进行前处理，提取完成后混匀使用。

v  加样

1.        各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，选择对应扩增片段参考表 7、8、9、10 所示加样：

加样完成后每孔总体积为 30 μL。

该示例表示的是检测各浓度梯度的 DNA 标准曲线、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、1 个待测样品。每个检测做 3 个重复孔。其中 1-3 列为 qPCR MIX-75， 4-6 列为 qPCR MIX-122，7-9 列为 qPCR MIX-244，10-12 列为 qPCR MIX-562。

实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.       将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。

v  qPCR 程序设置

²  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.    点击“实验向导”。

2.    “孔板编辑”页面中选择检测 Human-75 反应孔，选择步骤 2 项目中的“Human SIZE-75 bp”程序；选择检测 Human-122 反应孔，选择步骤 2 项目中的“Human SIZE-122 bp”程序；选择检测 Human-244 反应孔，选择步骤 2 项目中的“Human SIZE-244 bp”程序；选择检测 Human-562 反应孔，选择步骤 2 项目中的“Human SIZE-562 bp”程序。

3.    “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

²  其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.    四组 qPCR MIX 创建新检测探针，分别为命名为 qPCR MIX-75、qPCR MIX-122、 qPCR MIX-244、qPCR MIX-562，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。

3. 设置三步法反应程序： 95 ℃ 预变性 10 min ； 95 ℃ 15 s ， 60 ℃ 30 s ，72 ℃ 1 min 30 s，（读取荧光），40 个循环；反应体积 30 μL。  

各实验室可根据所用机型设置合理的反应程序。

v qPCR 结果分析

² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.       “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并进行赋值。“Human SIZE-75 bp、Human SIZE-122 bp、Human SIZE-244 bp 和 Human SIZE-562 bp”设为 300、30、3、0.3，0.03，并在相应的“样本名称”中命名为 ST1、 ST2、ST3、ST4、ST5。

2.       待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.       在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.       在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

² 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。

1.       在 Results 的 Amplification Plot 面板中，Human-75 将 Threshold 设置为 0.04， Human-122、Human-244、Human-562 将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.       在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 300、30、3、0.3、0.03（含义为每孔的模板浓度，单位为 pg/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

3.       在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击。

4.       在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取各标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.       在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

6.       以 MIX-75 的待测样品检测值为 100%，计算 MIX-122、MIX-244、MIX-562 的待测样品百分比。

7.       待测样品的Ct-IPC 均值与NCS 的Ct-IPC 均值在±1 个Ct 值范围内。若样品 Ct-IPC均值与 NCS Ct-IPC 均值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。

8.       阴性质控 NCS、无模板对照 NTC FAM 信号的 Ct 值应大于标曲最低浓度 FAM 信号 Ct 值。VIC 信号为有效的“S”型扩增曲线。

上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2023 年 02 月 27 日