产品信息：

• 检测类型：定量检测

• 产品规格：100测试

• 适用样品类型：对各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的Vero细胞DNA片段大小分布进行分析。

• 线性范围：85bp（3×10-2~3×102pg/μL，R2≥0.990，扩增效率为96.7%）；134bp（3×10-2~3×102pg/μL，R2≥0.990，扩增效率为96.4%）；229bp（3×10-2~3×102pg/μL，R2≥0.990，扩增效率为91.8%）；552bp（3×10-2~3×102pg/μL，R2≥0.990，扩增效率为92.8%）

• 样品回收率：50-150%

• LLOQ：3.00×10-2pg/μL

• 专属性：不受CHO、E.coli、MDCK和毕赤酵母等常见工程细胞基因组DNA的干扰。

• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在40%以内。

• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96、Roche LightCycler480、耶拿qTOWER3

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：定量下限低至3.00×10-2pg/μL，满足实际检测需求。

• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善

n  试剂盒简介

SHENTEK® Vero 残留 DNA 片段分析检测试剂盒（2G）是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 Vero 宿主细胞 DNA 残留片段大小分布的专用试剂盒。

本试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理，设计了四种不同的扩增片段（85 bp、134 bp、 229 bp、552 bp）来定量检测分析样品中 Vero 残留 DNA 片段的大小分布情况。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 Vero DNA 定量参考品。本试剂盒与宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用。

n  试剂盒组分

 n  规格

4×100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

Ø 7500 Real-Time PCR System

Ø CFX96 定量 PCR 系统

Ø LineGene 9600plus 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 1.5 mL 无菌离心管

Ø 96 孔 qPCR 板

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

Ø 荧光定量 PCR 仪

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  操作过程

v Vero DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

注：片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段，在建立标曲时，需分别对不同的扩增片段设置标曲，并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

Vero  DNA  定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。

 用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 Vero DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL，30 fg/μL。具体操作如下：

1.       将试剂盒中的 Vero DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3~5 s，如此重复 3 次。

2.       取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。

3.       在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 Vero DNA 定量参考品稀释至 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3~5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.       在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 180 μL DNA 稀释液。

5.       按表 2 依次进行 5 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37℃条件下进行孵育。

标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。

v 阴性质控 NCS 的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

1．取 100 μL DNA 稀释液加入至 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。  阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化

液。

v qPCR 反应液（qPCR MIX）的准备

1.       根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3

2.       根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：

qPCR MIX =（反应孔数+2）× 20 μL

3.       各试剂放在冰上或 2-8℃条件下融化，并参考表 3、4、5、6 所示准备对应扩增片段的 qPCR MIX：

为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求，样品前处理中的DNA 洗脱体积需要≥120 μL。

v 加样

1.       各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，选择对应扩增片段参考表 7、8、9、10 所示加样：

加样完成后每孔总体积为 30 μL。

该示例表示的是检测各浓度梯度的 DNA 标准曲线、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、1 个待测样品。每个检测做 3 个重复孔。其中 1~3 列为 qPCR MIX-85， 4~6 列为 qPCR MIX-134，7~9 列为 qPCR MIX-229，10~12 列为 qPCR MIX-552。

实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.       将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。

v qPCR 程序设置

² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.    点击“实验向导”。

2.    “孔板编辑”页面中选择检测 Vero-85 反应孔，选择步骤 2 项目中的“Vero SIZE-85 bp”程序；选择检测 Vero-134 反应孔，选择步骤 2 项目中的“Vero SIZE-134 bp”程序；选择检测 Vero-229 反应孔， 选择步骤 2 项目中的“Vero SIZE-229 bp” 程序； 选择检测 Vero-552 反应孔，选择步骤 2 项目中的“Vero SIZE-552 bp”程序。

3.    “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.       创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.       四组 qPCR MIX 创建新检测探针，分别为命名为 Vero-85、Vero-134、Vero-229、 Vero-552，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。

3．设置三步法反应程序：95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s（读取荧光），40 个循环；反应体积 30 μL。

各实验室可根据所用机型设置合理的反应程序。

v qPCR 结果分析

² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.       “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并进行赋值。“Vero SIZE-85 bp、Vero SIZE-134 bp、Vero SIZE-229 bp、Vero SIZE-552 bp”设为 300、30、3、0.3，0.03，并在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、 ST5。

2.       待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.       在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.       在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

²  以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。

1.       在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.       在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 300、30、3、0.3、0.03（含义为每孔的模板浓度，单位为 pg/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

3.       在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name

一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击。

4.      在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取各标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.       在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

6.       以 MIX-85 的待测样品检测值为 100%，计算 MIX-134、MIX-229、MIX-552 的待测样品百分比。

7.       建议同时测试加标样品，以样品回收率结果作为判定标准。IPC 结果受基质影响大，建议各实验室根据验证结果统计分析，确定 IPC 标准。

8.       NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。

结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。CFX96 型号定量PCR 仪，软件版本CFX Manager 2.0，阈值线可设置为300；LineGene 9600plus 定量 PCR 仪，软件版本 FQD-96a V1.0.02，阈值线可设置为 600。

修订日期：2023 年 01 月 16 日