产品信息：

• 检测类型：定量检测

• 产品规格：100测试

• 适用样品类型：对各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的HEK293细胞DNA片段大小分布进行分析。

• 线性范围：75bp：3×10^-2~3×10²pg/μL，R²≥0.990，扩增效率为101.2%；122bp：3×10^-2~3×10²pg/μL，R²≥0.990，扩增效率为101.1%；244bp：3×10^-2~3×10²pg/μL，R²≥0.990，扩增效率为102.1%；562bp：3×10^-2~3×10²pg/μL，R²≥0.990，扩增效率为96.8%

• 样品回收率：50-150%

• LLOQ：3.00×10^-2pg/μL

• 专属性：不受CHO、E.coli、MDCK和毕赤酵母等常见工程细胞基因组DNA的干扰。

• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在40%以内。

• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96、Roche LightCycler480

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：定量下限低至3.00×10^-2pg/μL，满足实际检测需求。

• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。

n  试剂盒简介

SHENTEK® HEK293 残留 DNA 片段分析检测试剂盒（PCR-荧光探针法）用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 HEK293 宿主细胞 DNA 残留片段大小分布的专用试剂盒。

本试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理，设计了四种不同的扩增片段（75bp、122bp、 244bp、562bp）来定量检测分析样品中 HEK293 残留 DNA 片段的大小分布情况。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 HEK293 DNA定量参考品。本试剂盒与宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用。该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。

n  试剂盒组分

n  规格

4×100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

Ø  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

Ø  7500 Real-Time PCR System

Ø  CFX96 定量 PCR 系统

Ø  FQD-96A 定量 PCR 系统

n   实验所需但试剂盒中未含材料

Ø  1.5 mL 低吸附无菌离心管

Ø  96 孔 qPCR 板或八联管

Ø  1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n   相关设备

Ø  荧光定量 PCR 仪

Ø  1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  实验操作流程

图 1 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.        工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。

3.        将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2-8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

（二）qPCR 反应液准备：

1.       反应孔数计算：根据检测样品的数量，计算所需反应孔数，一般做 3个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3

2.       MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。

MIX 总量 =（反应孔数+2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）

3.       qPCR MIX 配制：根据表 2、3、4、5 所示准备对应扩增片段的 qPCR MIX。

备注：为满足同步进行四种扩增片段检测，DNA 模板需≥120μL，建议每个样品同时准备 2 管进行前处理，提取完成后混匀使用。

二、样品准备

l HEK293  DNA  定量参考品的稀释和标准曲线的制备

HEK293  DNA  定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。

备注：片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段，在建立标曲时，需分别对不同的扩增片段设置标曲，并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行稀释，具体操作如下：

1.      将试剂盒中的 HEK293 DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下融化，待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 秒，如此重复 3 次。

2.      取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3， ST4，ST5。

3.      在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 HEK293 DNA 定量参考品稀释至 3ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3~5 秒，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.      在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 180μL DNA 稀释液。

5.      按表 6 依次进行 5 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。

l 阴性对照（NCS)

1. 取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控NCS。

备注：阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

三、操作步骤

（一）加样

1.       各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，参考表 7、8、9、10、11 所示加样：

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.   将96 孔板用光学膜封闭，轻微振荡混匀，短时间快速离心10 秒后放入qPCR仪。

（二）qPCR 程序设置

l  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：

1.    点击“实验向导”。

2.    “孔板编辑”页面中选择检测 HEK293-75 反应孔，选择步骤 2 项目中的“HEK293 SIZE-75bp”程序；选择检测 HEK293-122 反应孔，选择步骤 2 项目中的“HEK293 SIZE-122bp”程序；选择检测 HEK293-244反应孔，选择步骤 2 项目中的“HEK293 SIZE-244bp”程序；选择检测 HEK293-562 反应孔，选择步骤 2 项目中的“HEK293 SIZE-562bp”程序。

3.    “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

l  其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.       创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.       四组 qPCR MIX 创建新检测探针， 分别为命名为 HEK293-75 、

HEK293-122、HEK293-244、HEK293-562，选择报告荧光基团为 FAM，

猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。

3.       设置三步法反应程序：

95 ℃预变性 10 分钟；

95 ℃ 15 秒，60 ℃ 30 秒，72℃ 1 分 30 秒（读取荧光），40 个循环；反应体积 30μL。

各实验室可根据所用机型设置合理的反应程序。

四、结果计算与判断

（一）结果计算

l  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例： 1．“孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并进行赋值。“HEK293 SIZE-75bp、HEK293 SIZE-122bp、HEK293 SIZE-2445bp 和 HEK293 SIZE-562bp”设为 300、30、3、0.3、0.03，并在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、 ST4、ST5。

2.       待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.       在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.       在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例：

1.       在 Results 的 Amplification Plot 面板中，HEK293-75 将 Threshold 设置为 0.04，HEK293-122、HEK293-244、HEK293-562 将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.       在Results 的Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 300、30、3、0.3、0.03（含义为每孔的模板浓度，单位为 pg/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

3.       在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击

4.       在 Results 的 Standard Curve 面板中， 可读取各标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.       在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

6.       以 MIX-75 的待测样品检测值为 100%，计算 MIX-122、MIX-244、 MIX-562 的待测样品百分比。

（二）结果判断

1.       分析 IPC 的 Ct 均值，正常情况下样品 Ct-IPC 均值应在 NCS Ct-IPC均值±1.0 范围内。若样品 Ct-IPC 均值与 NCS Ct-IPC 均值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。

2.       阴性质控 NCS、无模板对照 NTC FAM 信号的 Ct 值应大于标曲最低浓度 FAM 信号 Ct 值。

 上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室的机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2023 年 07 月 05 日

生效日期：2023 年 07 月 14 日