本试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 BHK 宿主细胞 DNA 残留片段大小分布的专用试剂盒。
SHENTEK® BHK 残留DNA 片段分析检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 BHK 宿主细胞 DNA 残留片段大小分布的专用试剂盒。
本试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理，设计了四种不同的扩增片段（81 bp、134 bp、 216 bp、589 bp）来定量检测分析样品中 BHK 残留 DNA 片段的大小分布情况。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 BHK DNA 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用。
4 × 100 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统
Ø 7500 Real-Time PCR System
Ø LightCycler 480 II
Ø 1.5 mL 无菌离心管
Ø PCR 八联管或 96 孔 qPCR 板
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头
Ø 荧光定量 PCR 仪
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
v BHK DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备
片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段，在建立标曲时，需分别对不同的扩增片段设置标曲，并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。
用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 BHK DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL，30 fg/μL。具体操作如下：
1. 将试剂盒中的 BHK DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 s，如此重复 3 次。
2. 取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。
3. 在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 BHK DNA 定量参考品稀释至 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。
4. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 180 μL DNA 稀释液。
5. 按表 2 依次进行 6 次稀释操作。
已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。
若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。
标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。
1．取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。
阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
1. 根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
2. 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：
3. 各试剂放在冰上或 2-8 ℃条件下融化，并参考表 3、4、5、6 所示准备对应扩增片段的 qPCR MIX：
为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求，样品前处理中的DNA 洗脱体积需要≥120 μL。
1. 各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，选择对应扩增片段参考表 7、8、9、10 所示加样：
加样完成后每孔总体积为 30 μL。
该示例表示的是检测各浓度梯度的 DNA 标准曲线、1 个无模板对照 NTC、4 个待测样品、1 个阴性质控样品 NCS。每个检测做 3 个重复孔。
板 1 的 1-3 列为 qPCR MIX-81 各浓度梯度的 DNA 标准曲线和 1 个无模板对照 NTC，4-6 列为 qPCR MIX-81 的样品和 1 个阴性质控 NCS，7-9 列为 qPCR MIX-134 各浓度梯度的 DNA 标准曲线和 1 个无模板对照 NTC，10-12 列为 qPCR MIX-134 的样品和 1个阴性质控 NCS；
板 2 的 1-3 列为 qPCR MIX-216 各浓度梯度的 DNA 标准曲线和 1 个无模板对照 NTC，4-6 列为 qPCR MIX-216 的样品和 1 个阴性质控 NCS，7-9 列为 qPCR MIX-589 各浓度梯度的 DNA 标准曲线和 1 个无模板对照 NTC，10-12 列为 qPCR MIX-589 的样品和 1 个阴性质控 NCS。
实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
2. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。
² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. 点击“实验向导”。
2. “孔板编辑”页面中选择检测 BHK SIZE-81 反应孔，选择步骤 2 项目中的“BHK SIZE-81”程序；选择检测 BHK SIZE-134 反应孔，选择步骤 2 项目中的“BHK SIZE-134”程序；选择检测 BHK SIZE-216 反应孔，选择步骤 2 项目中的“BHK SIZE-216”程序；选择检测 BHK SIZE-589 反应孔，选择步骤 2 项目中的“BHK SIZE-589”程序。
3. “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
其他定量 PCR 系统程序设置如下：
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 四组 qPCR MIX 创建新检测探针，分别为命名为 BHK SIZE-81、BHK SIZE-134、 BHK SIZE-216、BHK SIZE-589，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none（如有）；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none（如有）；检测参比荧光为 ROX（可选）。
3．设置三步法反应程序：95 ℃预变性 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min30 s（读取荧光），40 个循环；反应体积 30 μL。
各实验室可根据所用机型设置合理的反应程序。
² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的样品类型一栏设置为标准品，并且在样品赋值一栏分别赋值为 300、30、3、0.3、0.03（含义为每孔的模板浓度，单位为 pg/μL），并且在相应的样品名称一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
2. 在孔板编辑面板中，将无模板对照 NTC 孔的样品类型一栏设置为无模板对照，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的样品类型一栏设置为待测样品，并且在相应的样品名称一栏中命名为 NTC、NCS、S1、S2、S3、S4。
3. 在“实验分析”页面点击
，可读取各标准曲线的斜率、截距、相关系数和扩增效率。
4. 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
5. 以 MIX-81 的待测样品检测值为 100%，计算 MIX-134、MIX-216、MIX-589 的待测样品百分比。
以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.4 为例。
1. 在Setup 的Plate Setup 面板的Define Targets and Samples 模块和Assign Targrts and Samples 模块中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 300、30、3、0.3、0.03（含义为每孔的模板浓度，单位为 pg/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
2. 在Setup 的Plate Setup 面板的Define Targets and Samples 模块和Assign Targrts and Samples 模块中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的Task 一栏设置为Unknown，并且在相应的Sample Name 一栏中命名为NTC、 NCS、S1、S2、S3、S4。
3. 在 Analysis 的 Amplification Plot 面板中，将 FAM 信号的 Threshold 设置为 0.02， VIC 信号的 Threshold 设置为 0.02，两种信号均为 Auto Baseline，点击 Analyze。
4. 在 Analysis 的 Standard Curve 面板中，可读取各标准曲线的斜率（Slope）、截距（Inter）、R2 和扩增效率（Eff%）。
5. 在 Analysis 的 View Well Table 面板中，Quantity 和 Quantity Mean 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
6. 以 MIX-81 的待测样品检测值为 100%，计算 MIX-134、MIX-216、MIX-589 的待测样品百分比。
7. 分析加标回收率（ERC）。一般要求 ERC 达到 50.0%-150.0%，若 ERC 偏低，则表明 DNA 的提取过程受到显著抑制，需要优化样品处理方案。此外，具体样品的 DNA加标量设定在其无加标测试值的 2-10 倍为宜，若比值与推荐值相比偏离较大，则表明加标量不合理，建议调整加标量。
8. 分析IPC 的Ct 值。待测样品的 Ct-IPC 值与NCS 的Ct-IPC 值在±1 个Ct 值范围内，若样品 Ct-IPC 值与 NCS Ct-IPC 值相比显著增大，则表明样品中可能存在 PCR 反应的抑制因子。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。
9. 阴性质控NCS FAM 信号的Ct 均值大于标曲最低浓度 FAM 信号 Ct 均值或扩增曲线无明显起峰，VIC 信号为有效的“S”型扩增曲线，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。
10. 无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35.00，VIC 信号为有效的“S”型扩增曲线。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
生效日期：2023 年 01 月 31 日
400-829-0116
