SHENTEK^® HPV18 E6/E7残留DNA片段分析检测试剂盒用于检测分析HeLa细胞来源的HPV18 E6/E7 DNA残留片段量。

本试剂盒采用PCR荧光探针法，检测快速，专一性强，性能可靠。

本试剂盒与SHENTEK^®宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用。

n  试剂盒简介

SHENTEK® HPV18 E6/E7 残留DNA 片段分析检测试剂盒用于检测分析HeLa 细胞来源的 HPV18 E6/E7 DNA 残留片段量。

本试剂盒采用 PCR 荧光探针法，设计了不同的扩增片段（E6：100bp 和 288bp；E7： 110bp 和 240bp）来分析样品中的 E6 和 E7 DNA 相应片段的残留水平。检测快速，专一性强，性能可靠。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用。

n  试剂盒组分

n  规格

4 ×100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

1.  7500 Real-Time PCR System

2.  CFX96 定量 PCR 系统

3.  LineGene 9600plus 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

1.  1.5ml 无菌离心管

2.  96 孔 qPCR 板

3.  1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

1.  荧光定量 PCR 仪

2.  1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  实验操作流程

图 1 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         穿戴适当的工作及保护服, 至少穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.         工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。

3.         将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2-8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

（二）qPCR 反应液准备：

1.       反应孔数计算：根据检测样品的数量，计算所需反应孔数，一般做 3个重复孔/样。

反应孔数=（6 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3

2.       MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。

MIX 总量 =（反应孔数+ 2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）

3.      qPCR MIX 配制：根据表 2-5 配制表准备各试剂 qPCR MIX 用量。表 2. E6-100 qPCR MIX 配制表

将 qPCR MIX 充分混匀后按照 20 μL/管分装至 8 联管或 96 孔板中，置于冰上或 2-8 ℃条件下备用。

二、样品准备

l HPV E6/E7 DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

l HPV E6/E7 DNA 定量参考品的浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行梯度稀释，具体操作如下：

1.    将试剂盒中的参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8℃条件下融化，待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3~5s，如此重复 3 次。

2.  取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5， ST6。

3.  在 ST0 管中用 DNA 稀释液将参考品稀释至 1×108copies /μL，得到 ST0，振荡混匀后短时间快速离心 3~5s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.    在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6 管中分别加入 180 μL DNA 稀释液。

5.    按表 2 依次进行 6 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。

l 阴性对照（NCS)

1．取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。备注：阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

三、操作步骤

（一）加样

1．各试剂置于冰上，轻轻振荡混匀，选择各自扩增片段按表 7-10 所示加样：表 7. E6-100 各反应孔加样示例

（二）IPC  组配制反应液的制备和加样

1.       每次实验需做一个无模板对照 NTC 和各个待测样品的 IPC 检测，根据表 11和表 12 配制。

² 该示例表示的是针对 E6-100 和 E6-288 检测分别做 6 个浓度梯度的标准曲线（ST1～ST6）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、2 个待测样品（S1， S2），还有针对 IPC 的无模板对照 NTC（IPC-NTC）和待测样品的 IPC(IPC-S1， IPC-S2)。建议做 3 个重复孔。

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

（三）qPCR 程序设置

以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。选择 FAM 通道代表 E6/E7 检测信号，选择 VIC 通道代表 IPC 检测信号。举例如下：

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.  创建新检测探针，例如命名为 E6-100，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none。创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX。

3.    设置两步法反应程序：

95℃预变性 10min；

95℃ 15 s，60℃ 1 min（读取荧光），40 个循环；反应体积 30μl。

四、结果计算与判断

1.  在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.  在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值 1e+007、1e+006、1e+005、1e+004、 1e+003、1e+002（单位为 copies /μL），并且在相应的 Sample Name一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。

3.  在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为NTC、NCS、S，之后点击。

4.  在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.  在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控 NCS、待测样品，单位为 copies /μL。

6.  基于实际样品基质与NCS 基质存在差异，请优先考虑样品回收率结果；如未测试加标样品，则样品的 Ct -IPC 值应该与 NCS 的 Ct -IPC 值一致或±1，如样品的 Ct -IPC 值与 NCS 的 Ct -IPC 值超出±1，则表明样品可能存在抑制。

 结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2024 年 06 月 14 日

生效日期：2024 年 06 月 20 日