产品信息：

• 检测类型：定量检测

• 产品规格：100测试

• 适用样品类型：对各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的E.coli细胞RNA进行分析。

• 线性范围：2.00×10²pg/μL~2.00×10^-3pg/μL；R²=1.000；扩增效率为104.6%

• 样品回收率：50-150%

• LLOQ：2×10^-3pg/μL

• 专属性：不受CHO、293T和毕赤酵母等常见工程细胞基因组DNA的干扰。

• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在15%以内。

• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96、博日FQD-96A

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：定量下限低至2×10^-3pg/μL，满足实际检测需求。

• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。

n  试剂盒简介

SHENTEK® E.coli 总RNA 残留检测试剂盒适用于定量检测生物制品中残留的大肠杆菌总 RNA；通过设计特异性引物和探针，将反转录和荧光探针 qPCR 检测技术融合，实现一步法定量检测总 RNA 残留；其检测快速，专一性强，性能可靠。

n  试剂盒组分

n  规格

100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

Ø 7500 Real-Time PCR System

Ø CFX96 定量 PCR 系统

Ø Linegene9600plus 定量 PCR 系统

Ø Roche LightCycler 480Ⅱ 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø1.5 mL 无菌 RNase Free 低吸附离心管

Ø96 孔 qPCR 板或八联管

Ø1000 μL，100 μL，10 μL 无菌 RNase Free 低吸附带滤芯枪头

ØDNase 及缓冲液

ØRNase inhibitor（可选）

ØSHENTEK^®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒（磁珠法）（货号：SK030203D100，可选）

n  相关设备

Ø迷你离心机

Ø漩涡振荡器

Ø金属浴或水浴锅

Ø荧光定量 PCR 仪

Ø1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

 n  操作过程

v E.coli RNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

E.coli  RNA  定量参考品浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。

 用试剂盒中提供的 RNase-Free H2O 将 E.coli RNA 定量参考品进行梯度稀释，具体操作如下：

1.       将试剂盒中的E.coli RNA 定量参考品和RNase-Free H2O 置于冰上或 2-8℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3~5s，如此重复 3 次。

2.       取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST，ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。

3.       在ST 管中用RNase-Free H2O 将E.coli RNA 定量参考品稀释至 2 ng/μL，得到 ST，振荡混匀后短时间快速离心 3~5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 RNase-Free H2O 充分混匀。

4.       在 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 45 μL RNase-Free H2O。

5.       按表 2 依次进行 6 次稀释操作。

v 待测样品的准备和处理

根据待测样品的类型不同，将样品的准备和处理分为以下两种情况：

Ø 情况 1：使用 E.coli 宿主菌进行扩增的质粒 DNA 类样品

1.   将待测样品、样品加标、NCS 进行 DNase 处理，以消除 gDNA 对检测的影响。消化体系可参考下表，具体以实际经验为准：

 2.       选择适当的 DNase 灭活或去除方式（三选一）：

（1） 方式 1：使用 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒（磁珠法）对待测样品、样品加标、NCS 的消化液进行 DNase 灭活。该灭活方式可实现对样品基质和消化反应液的纯化，排除基质效应。

样品前处理时要用 RNase-Free H2O 进行洗脱，洗涤液 B 用 DEPC 水配制。

因质粒 DNA 类样品基质较为简单，故可用以下流程进行 E.coli RNA 机取（手工提取流程可咨询湖州申科获取）：

（2） 方式 2：75℃，10min 加热灭活。

（3） 方式 3: 其他经过验证的 DNase 灭活或去除方式。

Ø 情况 2：使用 E.coli 宿主菌进行蛋白等表达产物制备的样品

1.    样品准备

（1） 待测样品：取 100 μL 待测样品加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为 S。

（2） 设置样品加标，与待测样品进行同步处理，作为回收率考察，根据需要设置样品加标中 E.coli RNA 标准品浓度（以制备 2 pg E.coli RNA 量的 ERC 为例）：取 100 μL 待测样品加入 1.5 mL 干净的离心管中，再加入 10 μLST3，充分混匀标记为 ERC。

 一般建议样品加标量设置为样品 E.coli RNA 实际残留量的 2-10 倍。若样品 E.coli RNA 实际残留量低于本试剂盒的定量限，加标量应设置到定量限范围之内，以保证检测结果的准确性。

（3） 设置阴性质控 NCS，与待测样品进行同步处理，以保证检测结果的准确性：取 100 μL 样品基质溶液或 RNase-Free H2O（根据实际经验确定）加入 1.5 mL 干净的离心管中标记为 NCS。

2.    样品处理

（1）     使用 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒（磁珠法）对待测样品、样品加标、NCS 进行提取。样品最后用 RNase-Free H2O 进行洗脱，洗涤液 B 用 DEPC 水配制。

（2）     将待测样品、样品加标及 NCS 纯化液进行 DNase 处理，以消除 gDNA 对检测的影响。 DNase 用量和消化条件可参考表 3（具体以实际经验为准）。

（3）     75℃，10min 加热灭活 DNase。

v qRT-PCR 反应液的制备

1.       根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线 + 1 个无模板对照 NTC + 1 个阴性质控NCS +待测样品数）× 

2.       根据反应孔数计算本次所需的 qRT-PCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：

qRT-PCR MIX =（反应孔数+2）× 15 μL

3.       各试剂置于冰上或 2-8℃条件下融化，轻微振荡混匀，按表 4 所示加样：

v 加样

1．上述各试剂置于冰上，轻微震荡混匀，按表 5 所示加样：

v IPC  组配制反应液的制备和加样

如已设置加标样品，则 IPC 组作为可选项执行。

1.       当选择做 IPC 组时，每次实验需做一个阴性质控（IPC-NCS）和各个待测样品的 IPC（IPC-S）检测，根据表 6 和表 7 配制。

 该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的标准曲线（ST1～ST5）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、3 个待测样品（S1～S3）、3 个样品加标（S1-ERC~S3-ERC）。针对 IPC 的阴性质控（IPC-NCS）和待测样品的 IPC（IPC-S1，IPC-S2）。每个检测做 3个重复孔。

实际检测时可根据样品多少，参照表 8 示例进行 96 孔板排版加样。

2. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR仪。

v qPCR 程序设置

² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.    点击“实验向导”。

2.    “孔板编辑”页面中选择检测荧光基团 FAM 样品反应孔，选择步骤 2 项目中的“E.coli 残留 RNA-FAM”程序；选择检测荧光基团 VIC 样品反应孔，选择步骤 2 项目中的“E.coli 残留 RNA-IPC”程序；

3.    “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

² 其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.    创建新检测探针，命名为 E.coli RNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 RNA IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。

3.    设置反应程序：50℃，15 min；

95℃预变性 30 s；

95℃ 10 s，60℃ 40 s（读取荧光），45 个循环；

反应体积 20 μL。

v qPCR 结果分析

² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.       “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，“E.coli 残留 RNA-FAM”分别设为 20、2、0.2、 0.02、0.002，并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

2.       待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.       在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.       在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。

1.       在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.       在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别根据表 2 赋值，设为 20、2、0.2、0.02、0.002（单位为 pg/μL），并且在相应的 Sample name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

3.       在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample name 一栏中命名为 NTC、 S 之后点击。

4.        在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.       在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、待测样品的大肠杆菌 RNA 的检测值，单位为 pg/μL。

 上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

6.       无模板对照 NTC 的 Ct 均值应大于标准曲线最低浓度点 2 个 Ct 值以上。

7.       样品加标回收率的合格范围为 50%-150%。

8.       当选择做 IPC 组时，样品的 Ct -IPC 值与 NCS 的 Ct -IPC 值相比明显不一致 (如，超出±1 个循环)，则表明样品可能存在干扰。请优先考虑加标回收率的结果，IPC 的测试结果作为参考。

修订日期：2023 年 12 月 18 日

生效日期：2024 年 01 月 02 日