本试剂盒适用于定量检测生物制品中残留的293T细胞总RNA；通过设计特异性引物和探针，将反转录和荧光探针qPCR检测技术融合，实现一步法定量检测总RNA残留；其检测快速，专一性强，性能可靠。
n 试剂盒简介
SHENTEK® 293T 总 RNA 残留检测试剂盒（RT-PCR 荧光探针法）适用于定量检测生物制品中残留的 293T 细胞总 RNA；通过设计特异性引物和探针，将反转录和荧光探针 qPCR 检测技术融合，实现一步法定量检测总 RNA 残留；其检测快速，专一性强，性能可靠。
该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。
n 试剂盒组分
n 规格
100 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
n 适用机型（包括但不限于）
1. SHENTEK-96S 实时荧光PCR 检测系统
2. 7500 Real-Time PCR System
3. CFX96 定量 PCR 系统
4. Linegene 9600plus 定量 PCR 系统
1. 1.5 mL RNase Free 低吸附离心管
2. 96 孔 qPCR 板或八联管
3. 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌 RNase Free 低吸附带滤芯枪头
4. DNase 及缓冲液
1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
图 1 操作流程示意图
1. 穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。
2. 工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。
3. 将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2-8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。
1. 根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+1 个阴性质控样品 NCS+待测样品数）×3
2. MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。
qRT-PCR MIX =（反应孔数+2）× 15 μL（含有 2 孔的损失量）
3. qPCR MIX 配制：根据表 2 配制表准备各试剂 qPCR MIX 用量
1．每次实验需做一个阴性质控样品（IPC-NCS）和各个待测样品的 IPC（IPC-S）检测，根据表 3 及反应孔数配制 IPC qRT-PCR MIX 用量。表 3. IPC qRT-PCR MIX 配制表
293T RNA 定量参考品浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。用试剂盒中提供的 RNase-Free H2O 将 293T RNA 定量参考品进行梯度稀释，具体操作如下：
1. 将试剂盒中的 293T RNA 定量参考品和 RNase-Free H2O 置于冰上或2-8 ℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心3-5 秒，如此重复 3 次。
2. 取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST，ST0，ST1，ST2，ST3， ST4，ST5。
3. 在ST 管用RNase-Free H2O 将 293T RNA 定量参考品稀释至 2ng /μL，得到 ST，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 秒，重复 3 次以确保定量参考品与 RNase-Free H2O 充分混匀。
4. 在 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 45 μL RNase-Free H2O。
5. 按表 4 依次进行 6 次稀释操作。
已融化未使用的 RNase-Free H2O 可保存于 2-8 ℃。
样品中残留RNA 的提取纯化可采用SHENTEK®宿主细胞残留DNA 样本前处理试剂盒（磁珠法）（货号：SK030203D100），随行阴性质控样品（NCS）。待测样品在检测前需要进行 DNase 处理以消除 gDNA 对检测的影响。DNase用量和消化条件需按实际样品优化，可咨询湖州申科获取相关建议。
1. 上述各试剂置于冰上，轻微震荡混匀，按表 5、6、7 所示加样：
该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的标准曲线（ST1～ST5）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控样品 NCS、3 个待测样品（S1～S3）。针对阴性质控样品的 IPC（IPC-NCS）和待测样品的 IPC（IPC-S1，IPC-S2, IPC-S3）。每个检测做 3 个重复孔。
实际检测时可根据样品多少，参照表 7 示例进行 96 孔板排版加样。
2. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 秒后放入 qPCR 仪。
l SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. 点击“实验向导”。
2. “孔板编辑”页面中选择检测荧光基团 FAM 样品反应孔，选择步骤 2 项目中的“293T 残留 RNA-FAM”程序；选择检测荧光基团 VIC样品反应孔，选择步骤 2 项目中的“293T 残留 RNA-IPC”程序；
3. “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
l 其他定量 PCR 系统程序设置如下：
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，命名为 293T RNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 RNA IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX。
3. 设置反应程序：
50 ℃，15 分钟；
95 ℃预变性 30 秒；
95 ℃ 10 秒，60 ℃ 40 秒（读取荧光），45 个循环；反应体积 20 μL。
l 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：
1．“孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，“293T 残留 RNA-FAM”分别设为 20、2、0.2、0.02、0.002，并且在相应的“样品名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
2. 待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。
3. 在“实验分析”页面点击
，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。
4. 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
l 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。
1. 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在Results 的Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity 一栏分别根据表 2 赋值，设为 20、2、0.2、0.02、0.002（单位为 pg /μl），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、 ST2、ST3、ST4、ST5。
3. 在 Results 的 Plate 面板中，将 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将 NCS 孔的 Task 一栏设置为 NCS，将待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S之后点击
。
4. 在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5. 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取 NTC、NCS、待测样品的 293T RNA 的检测值，单位为 pg /μL。
1. 无模板对照 NTC 的 Ct 均值应大于标准曲线最低浓度点 2 个 Ct 值以上。
2. NCS 检测结果应大于标准曲线最低浓度点 Ct 值。
3. 分析IPC 的Ct 值，正常情况下样品的 Ct-IPC 值应该与NCS 的Ct-IPC值一致或±1。如样品的 Ct-IPC 值与 NCS 的 Ct-IPC 值相比明显增大，则表明样品可能存在明显抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
修订日期：2023 年 07 月 05 日
生效日期：2023 年 07 月 14 日
400-829-0116
