大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli)又称大肠杆菌，其作为模式微生物被广泛应用于生命科学研究中。随着基因治疗产业的大力发展，大肠杆菌也被主要应用于质粒DNA（pDNA）的生产。由于质粒样品的常见提取工艺中往往使用条件剧烈的碱溶液进行细胞裂解和蛋白质变性，使得其中的HCPs与传统物理破碎法获得的HCPs有较大的差异，导致其在采用免疫学原理的检测方法时，残留检测结果差别较大。
本试剂盒专用于大肠杆菌（又名大肠埃希菌）克隆菌株，如DH5α、Top10、JM109等。在抗体制备时采用碱裂工艺制备的HCPs免疫动物，获得专用的抗体。适用于经碱液裂解工艺处理后的宿主细胞蛋白HCPs定量检测。
产品信息
• 产品名称：E.coli克隆菌碱裂HCP残留检测试剂盒（酶联免疫吸附法）
• 类型：ELISA（板式）
• 规格：96测试
• 检测时间：2小时20分钟
• 定量范围：3-729 ng/mL
• LLOQ：~3 ng/mL
• 专属性：与CHO、Vero、HEK293T 和汉逊酵母等宿主蛋白无交叉反应。
• 抗体覆盖率：70.0%-80.6%（IMBS-2D）; 85.5% (IMBS-MS）
• 量校准品的广谱性：质谱法可鉴定到1254个蛋白点，二维电泳银染条件下可识别1205个蛋白点。
产品特点
• 操作简单：全过程室温下即可完成。
• 灵敏度高：定量下限低至3 ng/mL，满足实际检测需求。
• 兼容性好：全流程可适配SHENTEK®全自动ELISA分析系统等自动化平台。
• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。
• 适配简单：客户仅需通过适用性验证即可进行样品测试与结果报告。
质量保证
• 关键原料储备充足，降低换批风险。
• 建立ISO13485质量管理体系，具体完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。
• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。
• 专业高效的质量团队，拥有丰富的质量分析经验。
n 产品名称
E.coli 克隆菌碱裂 HCP 残留检测试剂盒（酶联免疫吸附法）。
n 包装规格
96 测试/盒。
本试剂盒专用于大肠杆菌（又名大肠埃希菌）克隆菌株，如 DH5α、Top10、JM109等，经碱液裂解工艺处理后的宿主细胞蛋白 HCPs 定量检测，适用于碱裂法提取质粒工艺的中间品和原液等。该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。
由于在质粒样品的常见提取工艺中往往使用条件剧烈的碱溶液进行细胞裂解和蛋白质变性，使得其中的 HCPs 与传统物理破碎法获得的 HCPs 有较大的差异，导致其在采用免疫学原理的检测方法时，残留检测结果差别较大。
本试剂盒在抗体制备时采用碱裂工艺制备的 HCPs 免疫动物，获得专用的抗体。试剂盒是基于固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的技术形式检测样品中 E.coli 克隆菌 HCPs 的残留量。该分析方法通过包被针对 E.coli 克隆菌 HCPs 的多克隆抗体来捕获样品中的残留 HCPs，接着加入生物素标记的抗 E.coli 克隆菌 HCPs 抗体进一步孵育结合，随后加入 HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的链霉亲和素，温育后洗涤；加入 TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物反应，HRP 催化 H2O2 氧化 TMB 生成蓝色产物（最大吸收峰 655nm），随后加入终止液终止酶催化反应，生成黄色产物（最大吸收峰 450nm）。酶标仪采集 450nm 波长下吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的 HCPs 浓度成正相关。通过剂量－反应曲线可计算得出样品中 E.coli 克隆菌 HCPs 的浓度。
该方法对样品无需特殊处理，通过实际样品的适用性验证，在合适的稀释比例进行检测。本试剂盒检测快速，专一性强，性能稳定可靠。
n 试剂盒组分
n 储存条件及有效期
未开封试剂盒置 2-8 ℃保存，有效期为 12 个月。
开封组分的保存要求如下：
Ø 稀释用无菌离心管
Ø 拍干酶标板用吸水纸
Ø 加样槽
Ø 酶标仪（能够检测 450 nm 和 620-650 nm 区间内单一波长的吸光度值）
Ø 恒温培养箱
Ø 单道或多道的微量移液器
Ø 微孔板恒温振荡器（用于样品孵育，若没有配备该设备，可选择静置孵育，具体见操作方法）
Ø 恒温箱（可选）
Ø 洗板机（可选）
1. 样品：质粒产品的纯化工艺过程样品，原液等。应清澈透明，经离心或过滤等方式去除不溶物。
2. 存放：样品务必事先有稳定性的研究，明确最佳的保存条件；一般建议样品长期储存应放置于-65 ℃及以下环境中，且不宜反复冻融。
3. 对初次使用或样品 HCPs 含量未知的情况，强烈建议进行样品适用性验证，确定适宜的样品稀释倍数，以便更好进行后续常规检测。
相关验证方案可咨询我司技术支持。
1. 实验前准备
(1) 将 E.coli HCP-AC 校准品、校准品复溶液、铝箔袋密封的 E.coli HCP-AC 预包被酶标板从试剂盒内取出，于室温平衡 20 min。
(2) 取出浓缩缓冲液（10×），溶液如有结晶属正常现象，于 37 ℃温育直至完全溶解。
(3) 根据检测样品数量计算所需孔数，平衡后从铝箔袋中取出相应数量的预包被酶标板条，剩余板条连同干燥剂置于铝箔袋中密封，放回试剂盒中，保存在 2-8 ℃冰箱，请于效期内使用完。
(4) 其余试剂在下步使用前 20 min 取出于室温平衡，使用后需立即放回 2-8 ℃保存。备注：室温指 25 ℃±3 ℃，下同。若实验室室温波动大，孵育时建议放置恒温箱内。
2. 试剂配制
2.1 E.coli HCP-AC 校准品溶解
根据 E.coli HCP-AC 校准品西林瓶标签上的含量标识，务必精确量取校准品复溶液500 μL 于西林瓶中，轻柔颠倒混匀，静置 5 min，得到复溶校准品。
备注：不可用其他体积的复溶液溶解该校准品，根据标签信息计算复溶校准品浓度后再进行梯度稀释。
2.2 1×缓冲液配制
浓缩缓冲液（10×）用超纯水稀释 10 倍，例如取 25 mL 浓缩缓冲液（10×）加入 225 mL超纯水混匀，即为 1×缓冲液，用于稀释校准品、样品、生物素偶联 E.coli HCP-AC 抗体（20×）及链霉亲和素 HRP 复合物（100×）。建议现配现用。
2.3 校准曲线配制
参照表 3 示例对校准品进行梯度稀释。
2.4 样品处理
待测样品根据其预估所含的 HCPs 浓度，用 1×缓冲液稀释适当倍数，使其检测值落入校准曲线定量范围之中。
3. 标准操作步骤
3.1 加样孵育
(1) 单通道移液器配合无菌吸头准确移取 100 μL 系列校准品溶液及 1×缓冲液（NCS）加入相应微孔板中，溶液加入孔底部，操作时避免产生气泡，每个浓度做 3 个平行复孔，并记录各浓度孔所在位置。
(2) 将处理好的待测样品按同样操作加入相应微孔板中。加样后将微孔板用封板膜密封，放置于微孔板恒温振荡器上，室温条件下 300-500 rpm，振荡孵育 1h。（若没有配备微孔板恒温振荡器，可选择室温静置孵育 2 小时）
(3) 实际检测时可根据样品数量，参照下表 4 示例进行 96 孔板排版加样。表 4. 96 孔酶标板加样排版（示例）
该示例表示的是检测 7 个浓度梯度的校准曲线（ST1-ST6）、1 个阴性对照 NCS、 3 个待测样品（S1-S3）和每个样品加标回收 SRC（S1 SRC-S3 SRC）。每个检测做 3 个重复孔。
3.2 1×生物素偶联 E.coli HCP-AC 抗体孵育
3.2.1 抗体配制
(1) 将生物素偶联 E.coli HCP-AC 抗体（20×）提前 20 min 从 2-8 ℃取出，于室温平衡。
(2) 用 1×缓冲液于无菌离心管中将其稀释 20 倍，轻轻颠倒混匀，即为 1×生物素偶联 E.coli HCP-AC 抗体。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。
3.2.2 洗涤
倒去微孔板内反应液，加入 1×缓冲液洗板，340 μL/孔，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干。如此重复洗板 3 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可过久放置，避免微孔板干燥导致抗体活性下降。
3.2.3 孵育
取 1×生物素偶联 E.coli HCP-AC 抗体溶液倒入加样槽中，用多通道移液器配合无菌吸头快速将抗体溶液 100 μL/孔加入上述微孔板孔底部，勿引入气泡。封板膜密封后，于
室温避光反应 45 min。
3.3 链霉亲和素 HRP 复合物孵育
3.3.1 复合物溶液配制
用 1×缓冲液将链霉亲和素 HRP 复合物（100×）稀释 100 倍，轻轻颠倒混匀，即为 1×链霉亲和素 HRP 复合物溶液。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。
3.3.2 洗涤
将上述微孔板用 1×缓冲液洗板 3 次，于纸巾上拍干后，立即进行以下操作，避免干燥。
3.3.3 孵育
取 1×链霉亲和素 HRP 复合物溶液倒入加样槽中，用多通道移液器配合无菌吸头快速将溶液 100 μL/孔加入上述微孔板孔底部，勿引入气泡。封板膜密封后，于室温避光温育15 min。
3.4 显色
(1) 提前 20 min 将 TMB 显色液置于室温条件下平衡。
(2) 将上述板子用 1×缓冲液洗板 5 次，于纸巾上拍干后，立即进行以下操作，避免干燥。
(3) 取合适体积的 TMB 显色液于加样槽中，用多通道移液器迅速将 TMB 显色液 100 μL/孔加入上述微孔板中，于室温避光温育 15 min。此步骤勿用封板膜密封。
3.5 终止
取合适体积的终止液于加样槽中，用多通道移液器迅速将终止液 50 μL/孔加入上述微孔板中，加入顺序需同显色液加入顺序一致，加样时吸头应悬空，避免接触微孔板中溶液，切勿产生气泡。终止后的微孔板于室温避光放置 5 min。
3.6 测读
设定酶标仪波长 450nm 和 620-650nm（620-650nm 区间内单一波长均可），测定各孔OD 值。测定时不可覆盖封板膜或盖子。
若酶标仪没有配备长波长时，可以仅设定 450 nm 波长，但是需确保微孔板孔底干净，无指纹或刮痕。
4. 结果计算
(1) 各孔 OD450nm 数值需减去各自孔的长波长 OD 值。若酶标仪没有配备长波长时，可以省去此步骤。
(2) 各校准点和样品的 OD 值分别减去阴性对照的 OD 值后，将 3 个重复孔取均值，以校准点浓度值和 OD 值进行四参数拟合，获得校准曲线方程。将样品的平均 OD 值带入方程计算得到样品浓度。该浓度需乘以稀释倍数得到样品的实际浓度。
标曲的拟合软件可以用酶标仪自带的软件。如无，则建议采用专业的标曲制作软件，如 Curve Expert，ELISA Calc 等。
对于吸光度值超出校准品 ST1 的样品，可用 1×缓冲液稀释适宜倍数后再行测定，样品中 HCPs 抗原浓度值为稀释后测定值×稀释倍数。同时设置在该稀释度下的适宜加标样品，准确度（加标回收率）符合相应法规的方法学验证要求。
1. 本品仅适用于研究用途，不用于临床诊断。
2. 本品仅适用于 E.coli 克隆菌株碱裂工艺来源的宿主细胞蛋白含量检测。其他工艺的克隆菌 HCPs 检测请采用本公司提供的相应试剂盒。
3. 样品 pH 应保证在 6.5-8.5 之间，过低或过高的 pH 可能会造成测量值异常。
1. 校准曲线拟合范围：3-729 ng/mL，线性相关系数 R2>0.990。
2. 最低定量限 LLOQ：3 ng/mL。
3. 典型校准曲线如下图：
4. 特异性：与 CHO、Vero、HEK293T 和汉逊酵母宿主蛋白无交叉反应。
n 重要事项提醒
试剂盒的使用人员需经过培训，合格后方可使用。为了获得满意的检测结果，请您务必事先留意如下几点事项：
1. 所有的试剂配制务必使用无菌一次性的吸头、试管和加样槽等，切勿混用。避免微量移液器吸头连接部分的污染，建议每次实验前后用 75%酒精擦拭。规范移液操作，严禁液体倒吸到移液器，或未去掉吸头时横放在桌上。
2. 校准品和样品的稀释混匀要轻柔充分，勿产生大量泡沫。
3. 终止液为酸性溶液，在使用中注意眼睛、面部、手和衣服的防护。
4. 不同批次试剂盒不建议混用。
5. 配制缓冲液所用水需为无菌水或新鲜制备的超纯水，水温不得超过 37 度。
6. 加样时将样品加于酶标板底部，尽量不接触孔壁。注意不要有气泡，可轻轻晃动混匀。在上机检测前若有气泡存在，需用干净的 10 μL 吸头或针头等戳破，注意不要吸走孔内液体，导致结果误差大。
7. 在孵育反应时需给酶标板覆膜，防止样品蒸发。
8. 倒去缓冲液后应马上加后续溶液，勿让酶标孔处于干燥状态，以防影响试剂盒检测性能。
9. 不用的酶标板条需用试剂盒附带的自封铝箔袋避光保存，以免被其他样品污染，导致试剂盒报废。
10. 校准品配制、样品稀释等务必精确，配制时最小的取样量不要小于 5 μL，防止结果出现较大的误差。
11. 生物素偶联 E.coli HCP-AC 抗体（20×）和链霉亲和素 HRP 复合物（100×）请在使用前快速离心，将管盖中残留的试剂甩到管底，防止试剂的污染和损失。
12. 已稀释到工作浓度的校准品、生物素偶联 E.coli HCP-AC 抗体、链霉亲和素 HRP复合物等因无法保证其稳定性，不建议再次重复使用。
13. 显色液应是无色透明液体。吸取时务必更换干净的吸头，防止 HRP 污染。如发现已有淡蓝色，请弃用。
14. 确保加入终止液后 5-10min 再上机检测，结果更稳定，时间不超过 30min。
15. 由于叠氮钠能抑制 HRP 活性，对检测结果有很大影响，因此样品中不能添加叠氮钠。
若实验结果出现异常，请及时对未使用的酶标板和试剂进行妥善保管，对显色的酶标板实验结果拍照，保留实验原始数据。联系我司技术支持为您解决问题。以下常见的异常现象及解决方法供您参考：
问题描述 | 可能原因 | 解决方法 |
背景信号高 | 1. 稀释所用的水污染了 E.coli HCPs； 2. 配液所用移液器、吸头、离心管等耗材污染了 E.coli HCPs； 3. 操 作 环 境 不 洁 净 ， ELISA 试验操作区域与 E.coli 菌培养、破碎区域混用； 4. E.coli HCP-AC 校准品复溶、稀释过程中造成污染； 5. 洗板操作不规范； 6. 洗板次数不够，加液量不足，浸泡时间不足； 7. 试剂错配。 | 1. 使用无菌或新制备的超纯水稀释； 2. 移液器应专用，并使用无菌带滤芯吸头； 3. 试验操作分区，ELISA 操作实验室应无 E.coli 菌培养、破碎等高浓度 HCPs暴露的试验； 4. 校准品复溶、稀释操作应规范，瓶（管）口切勿触碰移液器外壁，造成管间交叉污染； 5. 手动洗板时移液器吸头应悬空，切勿触及管内液面； 6. 严格按照说明书推荐的加液量、洗板次数和浸泡时间，切勿随意更改； 7. 生物素偶联 E.coli HCP-AC 抗体（20×） 或者链霉亲和素 HRP 复合物（100×）使用时稀释错误。 |
读数后某些孔OD 值异常偏高 |
1. 手动洗板过程中，甩液不迅速，或反复多次甩板，造成孔间液体飞溅交叉污染； 2. 手动洗板后，纸巾上拍干时操作不当或未更换新纸巾； 3. 加样操作不当； 4. 温育时未覆盖封板膜； 5. 揭开封板膜时操作不当，导致孔内液体飞溅。 | 1. 手动洗板时，甩液应一次完成，快速彻底； 2. 板子拍干用的纸巾是一次性用品，不得重复使用。在纸巾上拍干时，每拍一次更换一个新位置或新纸张，勿使拍痕重叠，若残留液体造成纸巾湿透，应弃去旧纸巾，重新铺就多层纸巾，每洗板一次拍干 4-5 次为宜； 3. 加样应匀速加于微孔板孔底部，防止加在孔壁上缘，飞溅造成邻近孔污染； 4. 微孔板孵育时应覆盖封板膜防止液体蒸发和污染杂物； 5. 揭开封板膜时，将微孔板平放在水平桌面上，用一只手的拇指和食指紧紧压在板子两侧防止移动，另一只手从一个角开始匀速揭开封板膜，过程中 要始终保持板子不离开桌面，防止孔内液体飞溅。 |
1、《中国药典》三部，通则 3412, “大肠埃希菌菌体蛋白质残留量测定法”。
2、《 美 国 药 典 》 <1132> 章 节 , “Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals”。
3、《欧洲药典》2.6.34 章节, “HOST-CELL PROTEIN ASSAYS”。
4、YY/T 1183-2010 酶联免疫吸附法检测试剂（盒）。
修订日期：2024 年 07 月 15 日
生效日期：2024 年 07 月 23 日
400-829-0116
