Vero细胞系是一种来源于非洲绿猴肾细胞的非整倍性传代细胞系，被广泛应用于病毒感染分子机制的研究、疫苗及重组蛋白的生产，并被公认为是培养流感疫苗的理想细胞模型。自80年代起，Vero细胞便被用于生产脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗等。与其他产品杂质一样，Vero宿主残留蛋白（HCP）可能对生物制品的安全性和有效性产生不利影响，因此在生产监测、产品放行等过程中需要对其进行定量研究并进行严格控制。
SHENTEK®Vero细胞裂解型HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）是湖州申科自主研发的、具有完全自主知识产权的、实现关键试剂全国产化的Vero HCP通用检测试剂盒。本试剂盒适用于定量检测经细胞裂解工艺生产的各类生物制品中的Vero宿主细胞蛋白的残留，操作步骤少，快速，检测专一性强，性能稳定可靠。
产品信息：
• 类型：ELISA（板式）
• 规格：96测试
• 检测时间：3.5小时
• 定量范围：3-243 ng/mL
• 定量下限（LLOQ）：3 ng/mL
• 检测限（LOD）：1 ng/mL
• 专属性：与Sf9、E.coli、毕赤酵母等工程细胞基质宿主蛋白无交叉反应。
• 抗体覆盖率：65.1%-85.1%（IMBS-2D）; 76.9%(IMBS-MS，Unique Peptide≥2）
• 定量校准品的广谱性：二维电泳银染条件下可识别901个蛋白点，质谱法可鉴定到2756个蛋白点。
产品特点
• 操作简单：一步加样、一步洗涤，全过程室温下即可完成。
• 灵敏度高：定量下限低至1 ng/mL，满足实际检测需求。
• 兼容性好：全流程可适配SHENTEK®全自动ELISA分析系统等自动化平台。
• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。
• 适配简单：客户仅需通过适用性验证即可进行样品测试与结果报告。
• 灵活性高：针对复杂样品和特殊需求，可进行半定制化或定制化测试渝开发。
质量保证：
• 关键原料储备充足，降低换批风险。
• 建立ISO13485质量管理体系，涵盖产品研发、生产、交付、售后的全生命周期管理。
• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。
• 专业高效的质量团队，拥有丰富的质量分析经验。
n 产品名称
Vero 细胞裂解型 HCP 残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）
n 包装规格
96 测试/盒
n 预期用途
该试剂盒适用于定量检测细胞裂解工艺的各种生物制品的中间品、半成品和成品中Vero 宿主细胞蛋白的残留。
该试剂盒仅供研究使用，不可用于诊断。
n 检测原理
本试剂盒基于固相酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的方式对待测样品中残留 Vero HCPs 进行定量检测。该试剂盒内的多克隆抗体是通过裂解 Vero 细胞所得 HCPs 作为抗原，免疫绵羊获得血清，进而通过亲和纯化方法得到高质量抗体。抗体通过目前主流的覆盖率分析法规方法评估其覆盖率水平。
该分析方法通过在预包被抗 Vero HCPs 多克隆抗体的酶标板中加入校准品或待测样品、HRP 标记的抗 Vero HCPs 多克隆抗体进行共孵育；洗涤后，利用加入的 TMB 底物进行显色反应，最后使用终止液终止酶催化反应。利用酶标仪在 450 nm 波长下测读吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的 HCPs 浓度成正相关，通过剂量-反应曲线可计算得出样品中 Vero HCPs 的浓度。
本试剂盒对实际样品无需进行特殊处理，仅需通过合适的稀释比例进行适用性验证即可直接使用。本试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。
图 1 检测原理示意图
未开封试剂盒置 2-8 ℃保存，有效期为 12 个月。开封组分的保存要求如下：
1. 稀释用的无菌离心管
2. 拍干酶标板用吸水纸
3. 加样槽
1. 酶标仪（能够检测 450 nm 和 620-650 nm 区间内单一波长的吸光度值）
2. 单道或多道的微量移液器
3. 微孔板恒温振荡器
4. 恒温箱（可选）
5. 洗板机（可选）
n 实验操作流程
图 2 操作流程示意图
1. 取出试剂盒，于室温平衡约 20 分钟；使用后立即放回 2-8 ℃保存。
2. 根据检测样品数量计算所需孔数，取出相应数量的预包被酶标板条，剩余板条连同干燥剂置于自封袋中密封，放回试剂盒中，保存在 2-8 ℃冰箱，于效期内使用完。
备注：室温指 25 ℃ ± 3 ℃。
1. Vero HCP 校准品溶解：精确量取 500 μL 校准品复溶液，溶解校准品，轻柔颠倒混匀，静置 5 分钟，得到复溶校准品。
备注：根据标签信息计算复溶校准品浓度后再进行梯度稀释。若需同时使用多瓶校准品，请分别溶解后转移至 1.5 mL 无菌离心管，振荡混匀后使用；若每瓶复溶校准品涉及多次冻融，建议采用 1.5 mL 无菌离心管酌量分装后保存于-18 ℃及以下。
2. 1×缓冲液配制：浓缩缓冲液（10×）用超纯水稀释 10 倍，例如取 25 mL 浓缩缓冲液（10×）加入 225 mL 超纯水混匀，即为 1×缓冲液，用于洗板。建议现配现用。若采用洗板机洗涤，可能发生试剂量不够，可单独采购相同产品号的缓冲液。
备注：取出浓缩缓冲液（10×）和稀释液，观察如有结晶属正常现象，于37 ℃温育直至完全溶解。
3. 1×Vero HCP 酶标抗体配制：用稀释液于无菌离心管中将 Vero HCP 酶标抗体（100×）稀释 100 倍，轻轻颠倒混匀，即为 1×Vero HCP 酶标抗体。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。现配现用。
4. 校准曲线配制：参照图 3 和表 3 对校准品进行梯度稀释。
图 3 校准品稀释操作示例
备注：1ng/mL 作为锚定点参与校准曲线的拟合，但在方法学验证中对其浓度 CV 及相对偏差不做要求。
二、样品准备
l 样品：表达纯化工艺过程样品，原液等。应清澈透明，经离心或过滤等方式去除不溶物。
l存放：样品务必事先有稳定性的研究，明确最佳的保存条件；一般建议样品长期储存应放置于-65 ℃及以下环境中，且不宜反复冻融。
l处理：待测样品根据其预估所含的 HCPs 浓度，用稀释液稀释适当倍数，使其检测值落入校准曲线定量范围之中。
l对初次使用或样品 HCPs 含量未知的情况，强烈建议进行样品适用性验证，确定适宜的样品稀释倍数，以便更好进行后续常规检测。
备注：相关验证方案可咨询我司技术支持。
1. 加入1× Vero HCP 酶标抗体：取1× Vero HCP 酶标抗体溶液到加样槽中，用多通道移液器快速将抗体溶液 100 μL/孔加入微孔板孔底部，勿引入气泡。实际检测时可根据样品数量加样（可参考表 4 示例进行 96 孔板排版）。
2. 加入校准品和待测样品：准确移取 100 μL 系列校准品溶液、阴性对照（NCS）、待测样品加入相应微孔板中。每个浓度建议做 2-3 个平行复孔，并记录各浓度孔所在位置。
3. 加样完毕后将微孔板用封板膜密封，放置于微孔板恒温振荡器上，室温条件下 500-600 rpm，避光振荡孵育 3 小时。
² 该示例表示的是检测 6 个浓度梯度的校准曲线（ST1-ST6）、1 个阴性对照（NCS）、3 个待测样品（S1-S3）和每个样品加标回收（S1 SRC-S3 SRC）。
² 实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
² 客户可根据方法验证结果确定日常检测复孔数及是否设置加标回收。
1. 提前 20 分钟将 TMB 显色液置于室温条件下平衡。
2. 将上述板子用 1×缓冲液洗板，340 μL/孔，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干如此重复洗板 5 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。
3. 取合适体积的 TMB 显色液于加样槽中，用多通道移液器迅速将 TMB 显色液 100 μL/孔加入上述微孔板中，于室温避光温育 10 分钟。此步骤勿用封板膜密封。
1. 取合适体积的终止液于加样槽中，用多通道移液器迅速将终止液 50 μL/孔加入上述微孔板中。
备注：加入顺序需同显色液加入顺序一致，加样时吸头应悬空，避免接触微孔板中溶液，切勿产生气泡。
2. 终止后立即读数。
1. 设定酶标仪波长 450 nm 和 620-650 nm（620-650 nm 区间内单一波长均可），测定各孔 OD 值。测定时不可覆盖封板膜或盖子。
备注：若酶标仪没有配备长波长时，可以仅设定 450 nm 波长，但是需确保微孔板孔底干净，无指纹或刮痕。
1. 各孔 OD450 nm 数值需减去各自孔的长波长 OD 值。若酶标仪没有配备长波长时，可以省去此步骤。
2. 各校准点和样品的 OD 值分别减去阴性对照（NCS）的 OD 值后，重复孔取均值。
3. 分别以校准点浓度值和经步骤 2 处理后的OD 均值作为X 轴和Y 轴参数进行曲线拟合（共 6 个点），获得校准曲线方程。建议优先采用四参数拟合。校准曲线的拟合可以使用酶标仪自带的软件。如无，则建议采用专业的校准曲线拟合软件，如 Curve Expert，ELISA Calc 等。
4. 将样品的 OD 均值作为 Y 值代入步骤 3 获得的方程，回算 X 值计算样品浓度。
1. 对于吸光度值超出校准品 ST1 的样品，可用稀释液稀释适宜倍数后再行测定，则样品中 HCPs 抗原浓度值=稀释后测定值×稀释倍数。若同时设置在该稀释度下的适宜加标样品，回收率符合相应法规的方法学验证要求。
1. 本品仅适用于研究用途，不用于临床诊断。
2. 样品 pH 值应在 6.5-8.5 间，过低或过高的 pH 值可能会造成测量值异常。
1. 线性范围：3-243 ng/mL，线性相关系数 R2≥0.990。
2. LLOQ：3 ng/mL。
3. 典型校准曲线及其数据如下：
4. 特异性：与 Sf9、E. coli、毕赤酵母等工程细胞基质宿主蛋白无交叉反应。
试剂盒使用人员需经过培训，合格后方可使用。为了获得满意的检测结果，请您务必事先留意如下几点事项：
² 所有的试剂配制务必使用无菌一次性的吸头、试管和加样槽等，切勿混用。避免微量移液器吸头连接部分的污染，建议每次实验前后用 75 %酒精擦拭。规范移液操作，严禁液体倒吸到移液器，或未去掉吸头时横放在桌上。
² 校准品和样品的稀释混匀要轻柔充分，勿产生大量泡沫。
² 终止液为酸性溶液，在使用中注意眼睛、面部、手和衣服的防护。
² 不同批次试剂盒不建议混用。
² 配制缓冲液所用水需为无菌水或新鲜制备的超纯水，水温不得超过 37 ℃。
² 加样时将样品加于酶标板底部，尽量不接触孔壁。注意不要有气泡，可轻轻晃动混匀。在上机检测前若有气泡存在，需用干净的 10 μL 吸头或针头等戳破，注意不要吸走孔内液体，导致结果误差大。
² 在孵育反应时需给酶标板覆膜，防止样品蒸发。
² 倒去缓冲液后应马上加后续溶液，勿让酶标孔处于干燥状态，以防影响试剂盒检测性能。
² 不用的酶标板条需用试剂盒附带的自封铝箔袋避光保存，以免被其他样品污染，导致试剂盒报废。
² 校准品配制、样品稀释等务必精确，配制时最小的取样量不要小于 5 μL，防止结果出现较大的误差。
² Vero HCP 酶标抗体（100×）请在使用前快速离心，将管盖中残留的试剂甩到管底，防止试剂的污染和损失。
² 已稀释到工作浓度的校准品、1× Vero HCP 酶标抗体等因无法保证其稳定性，不建议再次重复使用。
² 显色液应是无色透明液体。吸取时务必更换干净的吸头，防止 HRP 污染。如发现已有淡蓝色，请弃用。
² 由于叠氮钠能抑制 HRP 活性，对检测结果有很大影响，因此样品中不能添加叠氮钠。
若实验结果出现异常，请及时对未使用的酶标板和试剂进行妥善保管，对显色的酶标板实验结果拍照，保留实验原始数据。联系我司技术支持为您解决问题。以下常见的异常现象及解决方法供您参考：
问题描述 | 可能原因 | 解决方法 |
1. 共耗试剂污染，如超纯水； 2. 共耗仪器污染，如移液器、离心机； | 1. 使用无菌或新制备的超纯水稀释； 2. 移液器应专用，并使用无菌带滤芯吸头； 3. 试验操作分区； 4. 校准品复溶、稀释应规范，瓶（管）口切勿触碰移液器外壁，造成管间交叉污染； 5. 手动洗板时移液器吸头应悬空，切勿触及管内液面； 6. 严格按照说明书推荐的加液量、洗板次数和浸泡时间，切勿随意更改； 7. Vero HCP 酶标抗体（100×）使用时未稀释 100 倍或稀释错误。 | |
3. 操作环境不洁净，ELISA 试验 操作区域与细胞培养、破碎区 | ||
域混用； | ||
背景信号高 | 4. Vero HCP 校准品复溶、稀释过程中造成污染； | |
5. 洗板操作不规范； 6. 洗板次数不够，加液量不足，浸泡时间不足； | ||
7. 试剂错配。 | ||
1. 试剂过期； 2. 实验过程未严格按照说明书进行。 | 1. 确认试剂盒及其各组分在有效期内，若已 | |
过期，请联系销售/采购部门更换； | ||
实验结果与参考性能参数相差较大 | 2. 实验前需对实验人员进行实操培训，保证实验顺利； 3. 对实验关键步骤，如使用浓度、加样量、 | |
孵育时间等需进行严格控制，不可以经验 | ||
值判断替代说明书； | ||
1. 进行回顾性审查或进行验证实验，确认各 | ||
试剂加样量准确、均一； | ||
复孔间平行性较差 | 1. 移液失误； 2. 移液枪精度差。 | 2. 对移液设备进行定期校准和测试； 3. 强烈建议对各样本做三重复以上。若同一 |
样本出现异常值，可采用适合的异常值剔 | ||
除方法去除异常值后进行数据处理。 |
l 中国药典<9012>生物样品定量分析方法验证指导原则
l EP<2.6.34> HOST-CELL PROTEIN ASSAYS
l FDA. Bioanalytical Method Validation
l ICH. M10 Bioanalytical Method Validation And Study Sample Analysis
l JP
l USP<1132>Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals
l USP<1103>Immumological Test Methods Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Elisa)
修订日期：2025 年 02 月 13 日
生效日期：2025 年 03 月 11 日
400-829-0116
