中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）是抗体、重组蛋白、疫苗等生物制品生产中广泛使用的动物细胞表达系统。在使用CHO宿主生产过程中，不可避免的会引入宿主细胞蛋白（HCP）杂质，即使较低残留水平下，HCPs也会存在免疫原性，降低产品蛋白稳定性等的风险。因此需对生物制品中残留的HCP进行定量分析，以保证纯化工艺的一致性和终产品的安全性。
本试剂盒是湖州申科自主研发、拥有自主知识产权的、实现关键试剂全国产化的CHO HCP通用检测试剂盒，用于CHO细胞系表达的生物制品(单抗，重组蛋白，疫苗等)中宿主细胞蛋白的残留检测。本试剂盒操作步骤少、快速、检测专一性强、性能稳定可靠。
产品信息：
• 名称：CHO HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）
• 类型：ELISA（板式）
• 规格：96测试
• 检测时间：3.5小时，一步法操作简易
• 定量范围：1~128 ng/mL
• 定量下限（LLOQ）：1 ng/mL
• 专属性：与MDCK、Vero、HEK293T、SF9、E.coli宿主蛋白和毕赤酵母宿主蛋白无交叉反应。
• 抗体覆盖率：71.0%-82.6%（IMBS-2D）; 86.8% (IMBS-MS，Unique Peptide≥2）
• 定量校准品的广谱性：质谱法可鉴定到2204个蛋白点，二维电泳银染条件下可识别826个蛋白点。
产品特点：
• 操作简单：一步加样、一步洗涤，全过程室温下即可完成。
• 灵敏度高：定量限低至1 ng/mL，满足实际检测需求。
• 兼容性好：全流程可适配SHENTEK®全自动ELISA分析系统等自动化平台。
• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。
• 适配简单：客户仅需通过适用性验证即可进行样品测试与结果报告。
• 灵活性高：针对复杂样品和特殊需求，可进行半定制化或定制化测试与开发。
质量保证：
• 建立ISO13485：2016质量管理体系，涵盖产品研发、生产、交付、售后的全生命周期管理。
• 关键原料储备充足，降低换批风险。
• 生产高度流水线化，历史多批次生产稳定。
• 专业高效的质量团队，拥有丰富的质量分析经验。
n 产品名称
通用名：CHO HCP 残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）。
n 包装规格
96 测试/盒。
本试剂盒用于 CHO 细胞系表达的生物制品(单抗，重组蛋白，疫苗等)中宿主细胞蛋白的残留检测。
该试剂盒仅供研究使用，不可用于诊断。
本试剂盒采用 CHO 细胞（K1&S）补料分批培养工艺制备 HCPs 免疫绵羊，获得专用抗体。试剂盒是基于固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay， ELISA），采用双抗体夹心的技术形式检测样品中 CHO HCPs 的残留量。该分析方法通过包被针对 CHO HCPs 的多克隆抗体来捕获样品中的残留 HCPs，向酶标板中同时加入校准品（或待测样品）和 HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的抗 CHO HCPs 抗体，温育后进行洗涤；加入 TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物反应，HRP 催化 H2O2 氧化 TMB 生成蓝色产物（最大吸收峰 655nm），随后加入终止液终止酶催化反应，生成黄色产物（最大吸收峰 450nm）。酶标仪采集 450nm 波长下吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的 HCPs 浓度成正相关。通过剂量－反应曲线可计算得出样品中 CHO HCPs 的浓度。
对实际样品无需特殊处理，可通过合适的稀释比例进行适用性验证，以确定本试剂盒是否适用。本试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。
图 1 检测原理示意图
未开封试剂盒置 2-8 ℃保存，有效期为 12 个月。开封组分的保存要求如下：
1. 稀释用的无菌离心管
2. 拍干酶标板用吸水纸
3. 加样槽
1. 酶标仪（能够检测 450 nm 和 620-650 nm 区间内单一波长的吸光度值）
2. 单道或多道的微量移液器
3. 微孔板恒温振荡器
4. 恒温箱（可选）
5. 洗板机（可选）
n 实验操作流程
图 2 操作流程示意图
1. 将试剂盒取出，在使用前于室温平衡约 20 分钟。
2. 试剂均需在下步使用前 20 分钟取出于室温平衡，使用后需立即放回 2-8 ℃保存。
3. 根据检测样品数量计算所需孔数，取出相应数量的预包被酶标板条，剩余板条连同干燥剂置于自封袋中密封，放回试剂盒中，保存在 2-8 ℃冰箱，请于效期内使用完。
备注：室温指 25 ℃ ± 3 ℃。
1. CHO HCP 校准品溶解：根据 CHO HCP 校准品西林瓶标签上的含量标识，务必精确量取校准品复溶液 0.5 mL 于西林瓶中，轻柔颠倒混匀，静置 5 分钟后使用。复溶后校准品溶液按照推荐保存方法于效期内使用。
备注：不可用其他体积的复溶液溶解该校准品。
2. 1×缓冲液配制：浓缩缓冲液（10×）用超纯水稀释 10 倍，例如取 25 mL浓缩缓冲液（10×）加入 225 mL 超纯水混匀，即为 1×缓冲液，专用于洗板。建议现配现用。若采用洗板机洗涤，可能发生试剂量不够，可单独采购相同产品号的缓冲液。
备注：取出浓缩缓冲液（10×）和稀释液，观察如有结晶属正常现象，于37 ℃温育直至完全溶解。
3. 检测抗体配制：用稀释液于无菌离心管中将其稀释 100 倍，轻轻颠倒混匀，即为 1×CHO HCP 酶标抗体。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。现配现用。
4. 校准曲线配制：参照图 3 和表 3 对校准品进行梯度稀释。
图 3 校准品稀释操作示例
二、样品准备
l 样品：细胞收获液，下游纯化中间样品，原液和成品等。应清澈透明，经离心或过滤等方式去除不溶物。
l 存放：样品务必事先有稳定性的研究，明确最佳的保存条件；一般建议样品长期储存应放置于-65 ℃及以下环境中，且不宜反复冻融。
l 处理：待测样品根据其预估所含的 HCPs 浓度，用稀释液稀释适当倍数，使其检测值落入校准曲线定量范围之中。
l 对初次使用或样品 HCPs 含量未知的情况，强烈建议进行样品适用性验证，确定适宜的样品稀释倍数，以便更好进行后续常规检测。
l 实验过程中建议加入贵司内控品或我司质控品保证实验有效性。我司质控品可单独购买。
备注：相关验证方案可咨询我司技术支持。
1. 加入检测抗体：取 1×CHO HCP 酶标抗体溶液到加样槽中，用多通道移液器快速将抗体溶液 100 μL/孔加入微孔板孔底部，勿引入气泡。实际检测时可根据样品数量加样（可参考表 4 示例进行 96 孔板排版）。
2. 加入校准品和待测样品：准确移取 100 μL 系列校准品溶液、稀释液（0值）、待测样品加入相应微孔板中。操作时避免产生气泡，每个浓度建议做 2-3 个平行复孔，并记录各浓度孔所在位置。
3. 加样完毕后将微孔板用封板膜密封，放置于微孔板恒温振荡器上，室温条件下 500-600 rpm，避光振荡孵育 3 小时。
² 该示例表示的是检测 6 个浓度梯度的校准曲线（ST1-ST6）、1 个阴性对照 NCS、3 个待测样品（S1-S3）和每个样品加标回收 SRC（S1 SRC-S3 SRC）。
² 实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
² 客户可根据方法验证结果确定日常检测复孔数及是否设置加标回收。
1. 提前 20 分钟将 TMB 显色液置于室温条件下平衡。
2. 将上述板子用 1×缓冲液洗板，340 μL/孔，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干如此重复洗板 5 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。
3. 取合适体积的 TMB 显色液于加样槽中，用多通道移液器迅速将 TMB 显色液 100 μL/孔加入上述微孔板中，于室温避光温育 15 分钟。此步骤勿用封板膜密封。
1. 取合适体积的终止液于加样槽中，用多通道移液器迅速将终止液 50 μL/孔加入上述微孔板中。
备注：加入顺序需同显色液加入顺序一致，加样时吸头应悬空，避免接触微孔板中溶液，切勿产生气泡。
2. 终止后立即读数。
1. 设定酶标仪波长 450 nm 和 620-650 nm（620-650 nm 区间内单一波长均可），测定各孔 OD 值。测定时不可覆盖封板膜或盖子。
备注：若酶标仪没有配备长波长时，可以仅设定 450 nm 波长，但是需确保微孔板孔底干净，无指纹或刮痕。
1. 各孔 OD450 nm 数值需减去各自孔的长波长 OD 值。若酶标仪没有配备长波长时，可以省去此步骤。
2. 各校准点和样品的 OD 值分别减去阴性对照的 OD 值后，重复孔取均值。
3. 以校准点浓度值和 OD 值进行四参数拟合，获得校准曲线方程。将样品的平均 OD 值带入方程计算得到样品浓度，该浓度需乘以稀释倍数得到样品的实际浓度。
4. 标曲的拟合软件可以用酶标仪自带的软件。如无，则建议采用专业的标曲制作软件，如 Curve Expert，ELISA Calc 等。
1．对于吸光度值超出校准品 ST1 的样品，可用稀释液稀释适宜倍数后再行测定，样品中 HCPs 抗原浓度值为稀释后测定值×稀释倍数。若同时设置在该稀释度下的适宜加标样品，回收率符合相应法规的方法学验证要求。
1. 本品仅适用于研究用途，不用于临床诊断。
2. 本品仅适用于 CHO 细胞系生产工艺来源的宿主细胞残留蛋白含量检测。
3. 样品 pH 值应在 6.5～8.5 间，过低或过高的 pH 值可能会造成测量值异常。
1. 线性范围：1-128 ng/ mL，线性相关系数 R2>0.990。
2. 最低定量限 LLOQ：1.0 ng/ mL。
3. 典型校准曲线如下图：
图 4 典型校准曲线
4. 特异性：与 MDCK、Vero、HEK293T、SF9、E.coli 宿主蛋白和毕赤酵母宿主蛋白无交叉反应。
试剂盒使用人员需经过培训，合格后方可使用。为了获得满意的检测结果，请您务必事先留意如下几点事项：
² 所有的试剂配制务必使用无菌一次性的吸头、试管和加样槽等，切勿混用。避免微量移液器吸头连接部分的污染，建议每次实验前后用 75 %酒精擦拭。规范移液操作，严禁液体倒吸到移液器，或未去掉吸头时横放在桌上。
² 校准品和样品的稀释混匀要轻柔充分，勿产生大量泡沫。
² 终止液为酸性溶液，在使用中注意眼睛、面部、手和衣服的防护。
² 不同批次试剂盒不建议混用。
² 配制缓冲液所用水需为无菌水或新鲜制备的超纯水，水温不得超过 37 ℃。
² 加样时注意不要有气泡，可轻轻晃动混匀。在上机检测前若有气泡存在，需用干净的 10 μL 吸头或针头等戳破，注意不要吸走孔内液体，导致结果误差大。
² 在孵育反应时需给酶标板覆膜，防止样品蒸发。
² 倒去缓冲液后应马上加后续溶液，勿让酶标孔处于干燥状态，以防影响试剂盒检测性能。
² 不用的酶标板条需用试剂盒附带的自封铝箔袋避光保存，以免被其他样品污染，导致试剂盒报废。
² 校准品配制、样品稀释等务必精确，配制时最小的取样量不要小于 5 μL，防止结果出现较大的误差。
² CHO HCP 酶标抗体（100×）请在使用前快速离心，将管盖中残留的试剂甩到管底，防止试剂的污染和损失。
² 已稀释到工作浓度的校准品、CHO HCP 酶标抗体等因无法保证其稳定性，不建议再次重复使用。
² 显色液应是无色透明液体。吸取时务必更换干净的吸头，防止 HRP 污染。如发现已有淡蓝色，请弃用。
² 由于叠氮钠能抑制 HRP 活性，对检测结果有很大影响，因此样品中不能添加叠氮钠。
若实验结果出现异常，请及时对未使用的酶标板和试剂进行妥善保管，对显色的酶标板实验结果拍照，保留实验原始数据。联系我司技术支持为您解决问题。以下常见的异常现象及解决方法供您参考：
问题描述 | 可能原因 | 解决方法 |
背景信号高 | 1. 稀释所用的水污染了 CHO HCPs； 2. 配液所用移液器、吸头、离心管等耗材污染了 CHO HCPs； 3. CHO HCP 校准品复溶、稀释过程中造成污染； 4. 洗板操作不规范； 5. 洗板次数不够，加液量不足，浸泡时间不足； 6. 试剂错配。 | 1. 使用无菌或新制备的超纯水稀释； 2. 移液器应专用，并使用无菌带滤芯吸头； 3. 校准品复溶、稀释应规范，瓶（管）口切勿触碰移液器外壁，造成管间交叉污染； 4. 手动洗板时移液器吸头应悬空，切勿触及管内液面； 5. 严格按照说明书推荐的加液量、洗板次数和浸泡时间，切勿随意更改； 6. CHO HCP 酶标抗体（100×）使用时未稀释 100 倍或稀释错误。 |
读数后某些孔 OD 值异常偏高 |
1. 手动洗板过程中，甩液不迅速，或反复多次甩板，造成孔间液体飞溅交叉污染； 2. 手动洗板后，纸巾上拍干时操作不当或未更换新纸巾； 3. 加样操作不当； 4. 温育时未覆盖封板膜； 5. 揭开封板膜时操作不当，导致孔内液体飞溅。 | 1. 手动洗板时，甩液应一次完成，快速彻底； 2. 板子拍干用的纸巾是一次性用品，不得重复使用。在纸巾上拍干时，每拍一次更换一个新位置或新纸张，勿使拍痕重叠；若残留液体造成纸巾湿透，应弃去旧纸巾，重新铺就多层纸巾，每洗板一次拍干 4-5次为宜； 3. 加样应匀速加于微孔底部，防止加在孔壁上缘，飞溅造成邻近孔污染； 4. 微孔板孵育时应覆盖封板膜防止液体蒸发和污染杂物； 5. 揭开封板膜时，将微孔板平放在水平桌面上，用一只手的拇指和食指紧紧压在板子两侧防止移动，另一只手从一个角匀速揭开封板膜，过程中要始终保持板子不离开 桌面，防止孔内液体飞溅。 |
l 《中国药典》2020 版三部,通则 3412，“大肠埃希菌菌体蛋白质残留量测定法”。
l 《 美 国 药 典 》 <1132> 章 节 , “Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals”。
l 《欧洲药典》2.6.34 章节， “HOST-CELL PROTEIN ASSAYS”。
l YY/T 1183-2010 酶联免疫吸附法检测试剂（盒）。
修订日期：2023 年 11 月 30 日
生效日期：2023 年 12 月 05 日
400-829-0116
