磷脂酶B样蛋白2（Phospholipase B-Like 2，PLBL2/PLBD2），因其强共纯化能力、强免疫原性和潜在的酶活性，被认为是CHO HCP的关键高风险因子之一。目前行业建议，需要开发特定的检测方法对这些已知蛋白或特定蛋白进行监控以更好地把控其潜在风险。

SHENTEK^® CHO PLBL-2残留检测试剂盒（酶联免疫吸附法）是湖州申科自主研发的、具有完全自主知识产权的CHO PLBL-2蛋白通用检测试剂盒。本试剂盒适用于基于CHO表达系统的生物制品中CHO HCP高风险蛋白PLBL-2的定量检测。本试剂盒操作步骤少，快速，检测专一性强，性能稳定可靠。

产品信息：

• 产品名称：CHO PLBL-2残留检测试剂盒（酶联免疫吸附法）

• 类型：ELISA（板式）

• 规格：96测试

• 检测时间：约2.5小时

• 定量范围：50-12800 pg/mL

• 定量下限（LLOQ）：50 pg/mL

• 检测限（LOD）：13 pg/mL

• 专属性：与常见表达宿主，如E.coli、MDCK、Sf-9等宿主蛋白无明显交叉反应。

产品特点：

•灵敏度高：定量下限低至50 pg/mL，满足实际检测需求。

• 兼容性好：全流程可适配SHENTEK^®全自动ELISA分析系统等自动化平台。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

• 适配简单：客户仅需要通过适用性验证即可进行样品测试与结果报告。

• 灵活性高：针对复杂样品和特殊需求，可进行半定制化或定制化测试与开发。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，涵盖产品研发、生产、交付、售后的全生命周期管理。

• 关键原料储备充足，降低换批风险。

• 生产高度流水线化，历史多批次生产稳定。

• 专业高效的质量团队，拥有丰富的质量分析经验。

n  产品名称

CHO PLBL-2 残留检测试剂盒（酶联免疫吸附法）

n  包装规格

96 测试/盒

n  预期用途

CHO PLBL-2 残留检测试剂盒（酶联免疫吸附法）适用于基于 CHO 表达系统的生物制品中CHO HCP 高风险蛋白 PLBL-2（phospholipase B-like 2，也称 PLBD-2）的定量检测，例如细胞培养上清样品、PAT 样品、DS/DP 样品等。

n  检测原理

本试剂盒基于固相酶联免疫吸附分析法（ Enzyme-linked Immunosorbent Assay， ELISA），采用双抗体夹心的方式对待测样品中 CHO PLBL-2 的含量进行定量检测。

该分析方法首先通过在预包被抗 CHO PLBL-2 抗体的酶标板中加入校准品或待测样品以捕获溶液中的 CHO PLBL-2，其次加入生物素标记的抗 CHO PLBL-2 抗体以形成夹心检测结构，随后加入链霉亲和素-辣根过氧化物复合物以放大检测信号；洗涤后，加入 TMB 底物进行显色反应，最后使用终止液终止酶催化反应。利用酶标仪在 450 nm 波长下测读吸光度，其吸光度与校准品或待测样品中的 CHO PLBL-2 的含量成正相关，通过校准品拟合的剂量-反应曲线即可计算得出待测样品中 CHO PLBL-2 的含量。

本试剂盒对待测样品无需进行特殊处理，仅需通过合适的稀释比例进行适用性验证即可直接使用。本试剂盒操作简单，快速，检测专一性强，性能稳定可靠。

图 1 检测原理示意图 

n  试剂盒组分

n  储存条件及有效期

未开封试剂盒置 2-8 ℃保存，有效期为 12 个月。开封组分的保存要求如下：

n  实验所需但试剂盒中未含材料

1.  稀释用无菌离心管

2.  移液器配套用枪头

3.  拍干酶标板用吸水纸

4.  加样槽

n  相关设备

1.  酶标仪（能够检测 450 nm 和 620-650 nm 区间内单一波长的吸光度值）

2.  单道或多道的微量移液器

3.  微孔板恒温振荡器

4.  恒温箱（可选）

5.  洗板机（可选）

n  实验操作流程

图 2 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备

1.         将试剂盒取出，在使用前于室温平衡约 20 分钟。在使用后立即放回 2-8 ℃保存。

2.        根据检测样品数量计算所需孔数，取出相应数量的预包被酶标板条，剩余板条连同干燥剂置于自封袋中密封，放回试剂盒中，保存在 2-8 ℃冰箱，于效期内使用完。

备注：室温指 25 ℃ ± 3 ℃。

（二）试剂配制

1.        CHO PLBL-2 校准品溶解：精确量取校准品复溶液 500 μL，溶解后轻柔颠倒混匀，静置 5-10 min，得到复溶校准品。根据标签信息计算复溶校准品浓度后进行梯度稀释。

备注：校准品溶解后，酌量分装、保存于-18 ℃及以下，避免反复冻融。

2.        1×缓冲液配制：浓缩缓冲液（10×）用超纯水稀释 10 倍，例如取 25 mL 浓缩缓冲液（10×）加入 225 mL 超纯水混匀，即为 1×缓冲液，用于洗板。议现配现用。若因采用洗板机洗涤而导致 1×缓冲液试剂量不足，可单独采购相同产品号的缓冲液。

备注：取出浓缩缓冲液（10×）和稀释液观察，如有结晶属正常现象，于

37 ℃温育直至完全溶解。

3.        1×生物素偶联抗 CHO PLBL-2 抗体溶液配制：用稀释液于无菌离心管中将生物素偶联抗 CHO PLBL-2 抗体（200×）稀释 200 倍，轻轻颠倒混匀，即为 1×生物素偶联抗 CHO PLBL-2 抗体溶液。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。配制后当天使用。

4.        1×链霉亲和素 HRP 复合物溶液配制：用稀释液于无菌离心管中将链霉亲和素 HRP 复合物（100×）稀释 100 倍，轻轻颠倒混匀，即为 1×链霉亲和素 HRP 复合物溶液。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。配制后当天使用。

5.        校准曲线配制：参照图 3 和表 3 对校准品进行梯度稀释。

图 3 校准品稀释操作示例

*ST7（25 pg/mL）为锚定点。

二、样品准备

l  样品：包括上游表达、下游纯化过程样品及原液、成品制剂等。样品应清澈透明，经离心或过滤等方式去除不溶物。

l  处理：待测样品根据其预估所含 CHO PLBL-2 的浓度，用稀释液稀释适当倍数，使其检测值落入校准曲线定量范围之中。建议样品稀释倍数选择 10 倍以上，保证稀释液发挥正常效应。

l  对初次使用或样品中 CHO PLBL-2 含量未知的情况，强烈建议进行样品适用性验证，确定适宜的样品稀释倍数，以便更好地进行后续常规检测。

备注：相关验证方案可咨询我司技术支持。

三、操作步骤

（一）孵育：校准品及待测样品

1.        准确移取 100 μL 系列校准品溶液、稀释液（NCS）、待测样品加入相应微孔板中。每个浓度建议做 2-3 个平行复孔，并记录各浓度孔所在位置。

2.        加样完毕后将微孔板用封板膜密封，放置于微孔板恒温振荡器上，室温条件下 600 rpm，避光振荡孵育 1 h。

²  该示例表示的是检测 7 个浓度梯度的校准曲线（ST1-ST7）、1 个阴性对照（ NCS ） 、 3 个待测样品（ S1-S3 ） 和每个样品的加标回收（S1+SRC-S3+SRC）。

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

²  客户可根据方法验证结果确定日常检测复孔数及是否设置加标回收。

（二）孵育：1×生物素偶联抗 CHO PLBL-2 抗体

1.        倒去反应液，用 1×缓冲液洗板，300 μL/孔，浸泡 30 s，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干。重复 3 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。本步骤也可由自动洗板机完成。

2.        准确移取 100 μL 1×生物素偶联抗CHO PLBL-2 抗体溶液至上述微孔板孔底部，勿引入气泡。封板膜密封后，于室温静置孵育 45 min。

（三）孵育：1×链霉亲和素 HRP 复合物

1.        倒去反应液，用 1×缓冲液洗板，300 μL/孔，浸泡 30 s，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干。重复 3 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。本步骤也可由自动洗板机完成。

2.        准确移取 100 μL 1×链霉亲和素 HRP 复合物溶液至上述微孔板孔底部，勿引入气泡。封板膜密封后，于室温静置孵育 30 min。

（四）显色

1.        提前 20 min 将 TMB 显色液置于室温条件下平衡。

2.        倒去反应液，用 1×缓冲液洗板，300 μL/孔，浸泡 30 s，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干。重复 5 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。本步骤也可由自动洗板机完成。

3.        准确移取 100 μL TMB 显色液至上述微孔板孔底部，勿引入气泡。于室温静置、避光孵育 10 min。此步骤勿用封板膜密封。

（五）终止及读数

1.       准确移取 50 μL 终止液加入上述微孔板中，加入顺序需同显色液加入顺序一致，加样时吸头应悬空，避免接触微孔板中溶液，切勿产生气泡。

2.       设定酶标仪波长 450 nm 和 620-650 nm（620-650 nm 区间内单一波长均可），测定各孔 OD 值。测定时不可覆盖封板膜或盖子。读板应于终止完成后 10 min 内完成。

四、结果计算与判断

（一）结果计算

1.        各孔 OD450 nm 数值需减去各自孔的长波长 OD 值。若酶标仪没有配备长波长时，可以省去此步骤。

2.        各校准点和样品的 OD 值分别减去阴性对照（NCS）的 OD 值后，重复孔取均值。

3.        分别以校准点浓度值和经步骤（2）处理后的 OD 均值作为 X 轴和 Y 轴参数进行曲线拟合（共 7 个点），获得校准曲线方程。建议优先采用四参数拟合。校准曲线的拟合可以使用酶标仪自带的软件。如无，则建议采用专业的校准曲线拟合软件，如 Curve Expert，ELISA Calc 等。

4.        将样品的 OD 均值作为 Y 值代入步骤（3）获得的方程，回算 X 值计算样品浓度。若样品是经过稀释后进行测试的，则样品终浓度=稀释后测定值×稀释倍数。

（二）结果判断

1.        校准曲线性能：典型校准曲线参数见（三）所述。校准曲线可能因实验人员的差异和环境的变化而有所差别，为正常现象。

2.        样品适用性：根据多个稀释倍数下的样品结果及其在对应稀释倍数下的适宜加标样品计算回收率，并评估其稀释线性，应符合相应法规的方法学验证要求。

3.        样品报告结果：对同一样品采用多个稀释倍数进行测试，样品结果采用符合样品适用性的多个稀释倍数下回算的均值。

（三）性能参数

1.    线性范围：50-12800 pg/mL，线性相关系数 R2≥0.990

2.        LLOQ：50 pg/mL

3.        特异性：与 Sf9 HCP、E. coli BL21 HCP、MDCK HCP 无明显交叉反应

4.        典型校准曲线及其参数

n  重要事项提醒

试剂盒使用人员需经过培训，合格后方可使用。为了获得满意的检测结果，请您务必事先留意如下几点事项：

²  所有的试剂配制务必使用无菌一次性的吸头、试管和加样槽等，切勿混用。避免微量移液器吸头连接部分的污染，建议每次实验前后用 75 %酒精擦拭。规范移液操作，严禁液体倒吸到移液器，或未去掉吸头时横放在桌上。

²  校准品和样品的稀释混匀要轻柔充分，勿产生大量泡沫。

²  终止液为酸性溶液，在使用中注意眼睛、面部、手和衣服的防护。

²  不同批次试剂盒不建议混用。

²  配制缓冲液所用水需为无菌水或新鲜制备的超纯水，水温不得超过 37 ℃。

²  加样时将样品加于酶标板底部，尽量不接触孔壁。注意不要有气泡，可轻轻晃动混匀。在上机检测前若有气泡存在，需用干净的 10 μL 吸头或针头等戳破，注意不要吸走孔内液体，导致结果误差大。

²  在孵育反应时需给酶标板覆膜，防止样品蒸发。

²  实验开始后，所有的步骤都应该按顺序进行且不可中断，勿让酶标板处于干燥状态，以防止出现过高的背景值或者错误的结果。

²  不用的酶标板条需用试剂盒附带的自封铝箔袋避光保存，以免被其他样品污染，导致试剂盒报废。

²  校准品配制、样品稀释等务必精确。例如，单步稀释倍数不超过 100 倍、样品最少取样量不小于 5 μL 等，以减少实验误差对结果判断带来的影响。

²  因生物素偶联抗 CHO PLBL-2 抗体（200×）、链霉亲和素 HRP 复合物（100×）装量较少，请在使用前快速离心，以防止试剂的污染和损失。

²  显色液应是无色透明液体。吸取时务必更换干净的吸头，防止 HRP 污染。如发现已有淡蓝色，请弃用。

²  由于叠氮钠能抑制 HRP 活性，对检测结果有很大影响，因此样品中不能添加叠氮钠。

n  常见问题分析

若实验结果出现异常，请及时对未使用的酶标板和试剂进行妥善保管，对显色的酶标板实验结果拍照，保留实验原始数据。联系我司技术支持为您解决问题。

以下常见的异常现象及解决方法供您参考。

n  参考文献

l  YY/T 1183-2010 酶联免疫吸附法检测试剂（盒）。

l  USP <1103> Immunological Test Methods - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

l  ICH. M10 Bioanalytical Method Validation And Study Sample Analysis

l  JP Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

生效日期：2024 年 12 月 04 日