本试剂盒适用于生物制品下游纯化工艺中猪源胰蛋白酶（Trypsin）的定量测定。该试剂盒能识别市面上常见的重组猪胰蛋白酶以及胰蛋白酶（猪胰腺）。
本 试 剂 盒 基 于 固 相 酶 联 免 疫 吸 附 分 析 法（ELISA），采用双抗体夹心的技术原理检测样品中Trypsin的残留量。
n 产品名称
通用名：猪源胰蛋白酶残留检测试剂盒（酶联免疫吸附法）。
n 包装规格
96 测试/盒。
本试剂盒适用于生物制品下游纯化工艺中猪源胰蛋白酶（Trypsin）的定量测定。该试剂盒能识别市面上常见的重组猪胰蛋白酶以及胰蛋白酶（猪胰腺）。该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。
猪源胰蛋白酶（Trypsin）是一种丝氨酸蛋白酶，可特异切割赖氨酸及精氨酸 C 末端肽键。主要用于重组胰岛素的生产，激活病毒颗粒，疫苗生产工艺中细胞的处理等。 本试剂盒基于固相酶联免疫吸附分析法（ Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的技术原理检测样品中 Trypsin的残留量。该分析方法通过包被针对 Trypsin 的多克隆抗体来捕获样品中的残留 Trypsin，接着加入生物素标记的抗 Trypsin 抗体进一步孵育结合，随后加入 HRP
（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的链霉亲和素，温育后洗涤；加入 TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物反应，HRP 催化 H2O2 氧化 TMB 生成蓝色产物（最大吸收峰 655 nm），随后加入终止液终止酶催化反应，生成黄色
产物（最大吸收峰 450 nm）。酶标仪采集 450 nm 波长下吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的 Trypsin 浓度成正相关。通过剂量－反应曲线可计算得出样品中 Trypsin 的浓度。
该方法对样品无需特殊处理，通过实际样品的适用性验证，在合适的稀释比例进行检测。本试剂盒检测快速，专一性强，性能稳定可靠。
注：下文中 Trypsin 表示猪源胰蛋白酶。
n 主要组分
1. 未开封试剂盒置 2-8 ℃保存，有效期为 12 个月。
2. 开封组分的保存要求如下：
Ø 稀释用的无菌离心管
Ø 拍干酶标板的吸水纸
Ø 加样槽
Ø 酶标仪能够检测 450 nm 吸光度值，如同时能再检测 620-650 nm 区间内任一波长的吸光度值更佳
Ø 恒温培养箱（25 ℃ ± 3 ℃）
Ø 单道和多道的微量移液器
Ø 洗板机
Ø 微孔板恒温振荡器
1. 样品：纯化工艺过程样品，原液等。应清澈透明，经离心或过滤等方式去除不溶物。
2. 存放：样品务必事先有稳定性的研究，明确最佳的保存条件；一般建议样品长期储存应放置于-65 ℃以下环境中，且不宜反复冻融。
3. 对初次使用或 Trypsin 含量未知的情况，强烈建议进行样品适用性验证，确定适宜的样品稀释倍数，以便更好进行后续常规检测。
4. 实验过程中建议加入贵司内控品或我司质控品保证实验有效性。我司质控品可单独购买。
n 操作方法
1. 实验前准备
(1) 将 Trypsin 残留检测试剂盒从 2-8 ℃冰箱取出，于室温平衡 20 min。
(2) 取出浓缩缓冲液（10×），溶液如有结晶是正常现象，于 37 ℃温育直至完全溶解。
(3) 根据检测样品数量计算所需孔数，平衡后从铝箔袋中取出相应数量的预包被酶标板条，剩余板条连同干燥剂置于铝箔袋中密封，放回试剂盒中，保存在 2-8℃冰箱，请于效期内使用完。
2. 试剂配制
2.1 Trypsin 校准品溶解
校准品原液配置，取出 Trypsin 校准品用微型离心机进行离心，精确量取 100 μL 校准品复溶液于可立冻存管中，用涡旋振荡器和微型离心机，振荡离心 3 次，复溶后校准品溶液按照推荐保存方法于效期内使用。
2.2 1×缓冲液配制
浓缩缓冲液（10×）用超纯水稀释 10 倍，例如取 25 mL 浓缩缓冲液（10×）加入 225 mL 超纯水混匀，即为 1×缓冲液，建议现配现用。
2.3 校准曲线配制
参照表 3 对校准品进行梯度稀释
2.4 样品处理
待测样品根据其预估所含的 Trypsin 浓度，用 1×缓冲液稀释适当倍数，使其检测值落入标曲定量范围之中。
3. 标准操作步骤
3.1 加样孵育
(1) 单通道移液器配合吸头准确移取 100 μL 系列校准品溶液及 1×缓冲液（NCS）加入相应微孔板中，溶液加入孔底部，操作时避免产生气泡，每个浓度做 3 个平行复孔，并记录各浓度孔所在位置。
(2) 将处理好的待测样品按同样操作加入相应微孔板中。加样后将微孔板用封板膜密封，放置于微孔板恒温振荡器上，室温，转速 500 rpm，避光孵育 1 h。
(3) 实际检测时可根据样品数量，参照下表 4 示例进行 96 孔板排版加样。
3.2 1×生物素偶联抗 Trypsin 抗体孵育
3.2.1 抗体配制
用 1×缓冲液于无菌离心管中将生物素偶联抗 Trypsin 抗体（100×）稀释 100倍，轻轻颠倒混匀 10 次，即为 1×生物素偶联抗 Trypsin 抗体。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。
3.2.2 洗涤
倒去微孔板内反应液，用 1×缓冲液洗板，洗板机参数设定：340 μL/孔，浸泡振荡 15 s，吸干，此步骤循环 3 次，机洗结束后，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干。
洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可过久放置，避免微孔板干燥导致抗体活性下降。
3.2.3 孵育
取 1×生物素偶联抗 Trypsin 抗体溶液倒入加样槽中，用多通道移液器配合吸头快速将抗体溶液 100 μL/孔加入上述微孔板孔底部，勿引入气泡。封板膜密封后，于室温避光反应 45 min。
3.3 链霉亲和素 HRP 复合物孵育
3.3.1 复合物溶液配制
用 1×缓冲液将链霉亲和素 HRP 复合物(100×)稀释 100 倍，轻轻颠倒混匀 10次，即为 1×链霉亲和素 HRP 复合物溶液。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。
3.3.2 洗涤
将上述微孔板用 1×缓冲液洗板 3 次，于纸巾上拍干后，立即进行以下操作，避免干燥。
3.3.3 孵育
取 1×链霉亲和素 HRP 复合物溶液倒入加样槽中，用多通道移液器配合无菌吸头快速将溶液 100 μL/孔加入上述微孔板孔底部，勿引入气泡。封板膜密封后，于室温避光反应 30 min。
3.4 显色
(1) 将上述板子用 1×缓冲液洗板 5 次，于纸巾上拍干后，立即进行以下操作，避免干燥。
(2) 取合适体积的 TMB 显色液于加样槽中，用多通道移液器迅速将 TMB 显色液 100 μL/孔加入上述微孔板中，于室温避光反应 15 min。此步骤勿用封板膜密封。
3.5 终止
取合适体积的终止液于加样槽中，用多通道移液器迅速将终止液 50 μL/孔加入上述微孔板中，加入顺序需同显色液加入顺序一致，加样时吸头应悬空，避免接触微孔板中溶液，切勿产生气泡。终止后的微孔板于室温避光放置 5 min。
3.6 测读
设定酶标仪波长450 nm 和620-650 nm（620-650 nm 区间内单一长波长均可），测定各孔 OD 值。测定时不可覆盖封板膜或盖子。
若酶标仪没有配备长波长时，可以仅设定 450 nm 波长，但是需确保微孔板孔底干净，无指纹或刮痕
4. 结果计算
(1) 各孔 OD450 nm 数值需减去各自孔的长波长 OD 值。若酶标仪没有配备长波长时，可以省去此步骤。
(2) 各校准点的 OD 值减去 NCS（1×缓冲液对应的 OD450 nm 均值）的 OD值后，将 3 个重复孔取均值，以浓度值和 OD 值进行四参数拟合，获得校准曲线方程。将样品的平均 OD 值带入方程计算得到样品浓度。该浓度需乘以稀释倍数得到样品的实际浓度。
(3) 标曲的拟合软件可以用酶标仪自带的软件。如无，则建议采用专业的标曲制作软件，如 curve expert，ELISA Calc 等。
对于吸光度值超出校准品 ST1 的样品，可用 1×缓冲液稀释适宜倍数后再行测定，样品中 Trypsin 浓度值为稀释后测定值×稀释倍数。同时设置在该稀释度下的适宜加标样品，回收率符合相应法规的方法学验证要求。
1. 本品仅适用于研究用途，不用于临床诊断。
2. 本品仅适用于 Trypsin（猪源胰蛋白酶）残留检测。
3. 样品 pH 应保证在 6.0-8.0 之间，过低或过高的 pH 可能会造成测量值异常。
1. 校准曲线拟合范围：0.040-2.56 ng/mL，线性相关系数 R2≥0.990。
2. 最低定量限 LLOQ：0.040 ng/mL。
3. 典型校准曲线如下图：
4. 精密性：板内变异系数不高于 15%，板间变异系数不高于 20%。
5. 特异性：与宿主残留蛋白（CHO、E.coli BL21、293T、Vero、汉逊酵母、 MDCK）无交叉反应。与人胰蛋白酶和牛胰蛋白酶的交叉反应率小于 0.01%。
n 重要事项提醒
试剂盒的使用人员需经过培训，合格后方可使用。为了获得满意的检测结果，请您务必事先留意如下几点事项：
1. 对初次使用或 Trypsin 含量未知的情况，强烈建议进行样品适用性验证，确定适宜的样品稀释倍数，以便更好进行后续常规检测。
2. 所有的试剂配制务必使用一次性的吸头、试管和加样槽等，充分混匀。避免微量移液器与吸头连接部分的污染，建议每次实验前后用 75%酒精擦拭移液器。规范移液操作，严禁液体倒吸至移液器中，或未去掉吸头时横放在试验台上。
3. 校准品和样品的稀释混匀要轻柔充分，勿产生大量泡沫。
4. 终止液为酸性溶液，在使用中注意眼睛、面部、手和衣服的防护。
5. 不同批次试剂盒不建议混用。
6. 配制缓冲液所用水需为无菌水或新鲜制备的超纯水，水温不得超过 37 ℃。
7. 加样时将样品加于酶标板底部，尽量不接触孔壁。注意不要有气泡，可轻轻晃动混匀。在上机检测前若有气泡存在，需用干净的 10 μL 吸头或针头等戳破，注意不要吸走孔内液体，导致结果误差大。
8. 在孵育反应时需给酶标板覆膜，防止样品蒸发。
9. 倒去缓冲液后应马上加后续溶液，勿让酶标孔处于干燥状态，以防影响试剂盒检测性能。
10. 未使用的酶标板条需用试剂盒附带的自封铝箔袋避光保存，以免被其他样品污染，导致试剂盒报废。
11. 校准品配制、样品稀释等务必精确，配制时最小的取样量不要小于 5 μL，防止结果出现较大的误差。
12. 生物素偶联抗 Trypsin 抗体（100×）和链霉亲和素 HRP 复合物（100×）试剂请在用前进行快速离心，将管盖中残留的试剂甩到管底，防止试剂的污染和损失。
13. 已稀释到工作浓度的校准品、生物素偶联抗 Trypsin 抗体、链霉亲和素
HRP 复合物等因无法保证其稳定性，不建议再次重复使用。
14. 显色液应是无色透明液体。吸取时务必更换干净的吸头，防止 HRP 污染。如发现已有淡蓝色，请弃用。
15. 终止 5 min 后再上机检测，结果更稳定。
16. 由于叠氮钠能抑制 HRP 活性，对检测结果有很大影响，因此样品中不能添加叠氮钠。
17. 推荐使用多孔道洗板机进行洗板，无洗板机可进行手工洗板。
若实验结果出现异常，请及时对未使用的酶标板和试剂进行妥善保管，对显色的酶标板实验结果拍照，保留实验原始数据。联系我司技术支持为您解决问题。以下常见的异常现象及解决方法供您参考：
问题描述 | 可能原因 | 解决方法 |
1. 使用无菌或新制备的超纯水稀释缓 | ||
冲液； | ||
1. 稀释所用的水污染； | 2. 移液器应专用，并使用无菌带滤芯吸 | |
2. 配液所用移液器、吸 | 头； | |
头、离心管等耗材污 | 3. 试验操作分区； | |
背景信号高：样品稀释液对应 OD450 值超过 0.150 | 染； 3. 操作环境不洁净； 4. Trypsin 校准品稀释过程中造成污染； 5. 洗板操作不规范； | 4. 校准品稀释操作应规范，瓶（管）口切勿触碰移液器外壁，造成管间交叉污染； 5. 手动洗板时移液器吸头应悬空，切勿 触及管内液面； |
6. 洗板次数不够，加液量 | 6. 严格按照说明书推荐的加液量、洗板 | |
不足，浸泡时间不足； | 次数和浸泡时间，切勿随意更改； | |
7. 试剂错配。 | 7. 生物素偶联抗 Trypsin 抗体（100×） | |
或者链霉亲和素 HRP 复合物(100×) | ||
使用时未稀释 100 倍或稀释错误。 | ||
1. 手动洗板过程中，甩液不迅速，或反复多次甩 | 1. 手动洗板时，甩液应一次完成，快速彻底； 2. 板子拍干用的纸巾是一次性用品，不得重复使用。在纸巾上拍干时，每拍一次更换一个新位置或新纸张，勿使拍痕重叠，若残留液体造成纸巾湿透，应弃去旧纸巾，重新铺就多层纸巾，每洗板一次拍干 4~5 次为宜； 3. 加样应匀速加于微孔板孔底部，防止加在孔壁上缘，飞溅造成邻近孔污染； 4. 微孔板孵育时应覆盖封板膜防止液体蒸发和污染杂物； 5. 揭开封板膜时，将微孔板平放在水平桌面上，用一只手的拇指和食指紧紧压在板子两侧防止移动，另一只手从一个角开始匀速揭开封板膜，过程中 要始终保持板子不离开桌面，防止孔内液体飞溅。 | |
板，造成孔间液体飞溅 | ||
交叉污染； | ||
读数后某些孔 | 2. 手动洗板后，纸巾上拍 干时操作不当或未更 | |
OD 值异常偏高 | 换新纸巾； | |
3. 加样操作不当； 4. 温育时未覆盖封板膜； 5. 揭开封板膜时操作不当， 导致孔内液体飞 | ||
溅。 |
1、YY/T 1183-2010 酶联免疫吸附法检测试剂（盒）。
2、中国药典（2020）生物制品通则《生物制品生产用原材料及辅料质量控制》。
生效日期：2023 年 01 月 09 日
400-829-0116
