本试剂盒适用于生物制品制备工艺中残留的重组胰蛋白酶类似物定量测定，可适用于Thermo的TrypLETM、赛多利斯的Recombinant Trypsin、Cytiva 的HyrTryp™等酶的残留检测。

n  产品名称

通用名：重组胰蛋白酶类似物残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）。

n  包装规格

96 测试/盒。

n  预期用途

本试剂盒适用于生物制品制备工艺中残留的重组胰蛋白酶类似物定量测定，可适用于 Thermo 的 TrypLETM、赛多利斯的 Recombinant Trypsin、Cytiva 的 HyrTryp™等酶的残留检测。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。

n  检测原理

重组胰蛋白酶类似物是一种非动物源高纯度的重组真菌酶， 通过尖孢镰刀菌 DSM2672 发酵生产获得。与胰蛋白酶一样，可裂解赖氨酸和精氨酸 C-末端上的肽键，可用于分离多种贴壁哺乳动物细胞，包括 HEK293、A549、原代人角质化细胞和胚胎干细胞等。

本试剂盒采用重组胰蛋白酶类似物免疫绵羊，获得特异性多克隆抗体。试剂盒是基于固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的技术形式检测样品中重组胰蛋白酶类似物的残留量。该分析方法通过包被的绵羊多克隆抗体来捕获样品中的残留重组胰蛋白酶类似物，向酶标板中同时加入校准品（或待测样品）和 HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的抗体，温育后进行洗涤；加入TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物反应，HRP 催化 H2O2 氧化 TMB 生成蓝色产物（最大吸收峰 655 nm），随后加入终止液终止酶催化反应，生成黄色产物（最大

吸收峰 450 nm）。酶标仪采集 450 nm 波长下吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的重组胰蛋白酶类似物浓度成正相关。通过剂量－反应曲线可计算得出样品中重组胰蛋白酶类似物的浓度。

对实际样品无需特殊处理，可通过合适的稀释比例进行适用性验证，以确定本试剂盒是否适用。本试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。

 图1 检测原理示意图

n  试剂盒组分

n  储存条件及有效期

试剂盒（包括开封试剂）置 2-8 ℃保存，有效期为 12 个月。

n  实验所需但试剂盒中未含材料

1.  无菌离心管

2.  吸水纸

3.  一次性加样槽

n  相关设备

1.  酶标仪（能够检测 450 nm 和 620-650 nm 区间内单一波长的吸光度值）

2.  单道或多道的微量移液器

3.  微孔板恒温振荡器

4.  恒温箱（可选）

5.  洗板机（可选）

n  实验操作流程

图 2 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         将试剂盒取出，在使用前于室温平衡约 20 分钟。

2.         试剂均需在下步使用前 20 分钟取出于室温平衡，使用后需立即放回 2-8 ℃保存。

3.        根据检测样品数量计算所需孔数，取出相应数量的预包被酶标板条，剩余板条连同干燥剂置于自封袋中密封，放回试剂盒中，保存在 2-8 ℃冰箱，请于效期内使用完。

备注：室温指 25 ℃ ± 3 ℃。

（二）试剂配制：

1.        1×缓冲液配制：浓缩缓冲液（10×）用超纯水稀释 10 倍，例如取 25 mL 浓缩缓冲液（10×）加入 225 mL 超纯水混匀，即为 1×缓冲液，专用于洗板。建议现配现用。

备注：取出浓缩缓冲液（10×）和稀释液，观察如有结晶属正常现象，于37 ℃温育直至完全溶解。

2.        检测抗体配制：用稀释液于无菌离心管中将其稀释 100 倍，轻轻颠倒混匀，即为 1×重组胰蛋白酶类似物酶标抗体。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。现配现用。

3.        校准曲线配制：参照图 3 和表 2 对校准品进行梯度稀释。

图 3 校准品稀释操作示例

注：建议先将校准品原液稀释 100 倍，即 10 μL 校准品原液加入到 990μL 稀释液中混匀。用100 倍稀释后的校准品配制 ST1。

二、样品准备

l  样品：细胞收获液，下游纯化中间样品，原液和成品等。应清澈透明，经离心或过滤等方式去除不溶物。

l  存放：样品务必事先有稳定性的研究，明确最佳的保存条件；一般建议样品长期储存应放置于-65 ℃及以下环境中，且不宜反复冻融。

l  处理：待测样品根据其预估所含的重组胰蛋白酶类似物浓度，用稀释液稀释适当倍数，使其检测值落入校准曲线定量范围之中。

l  对初次使用或样品重组胰蛋白酶类似物含量未知的情况，强烈建议进行样品适用性验证，确定适宜的样品稀释倍数，以便更好进行后续常规检测。

备注：相关验证方案可咨询我司技术支持。

三、操作步骤

（一）加样孵育

1.        加入检测抗体：取 1×重组胰蛋白酶类似物酶标抗体溶液到加样槽中，用多通道移液器快速将抗体溶液 100 μL/孔加入微孔板孔底部，勿引入气泡。实际检测时可根据样品数量加样（可参考表 3 示例进行 96 孔板排版）。

2.        加入校准品和待测样品：准确移取 100 μL 系列校准品溶液、稀释液（阴性对照 NCS）、待测样品加入相应微孔板中。操作时避免产生气泡，每个浓度建议做 2-3 个平行复孔，并记录各浓度孔所在位置。

3.        加样完毕后将微孔板用封板膜密封，放置于微孔板恒温振荡器上，室温条件下 600 rpm，避光振荡孵育 2 小时。

²  该示例表示的是检测 7 个浓度梯度的校准曲线（ST1-ST7）、1 个阴性对照 NCS、3 个待测样品（S1-S3）和每个样品加标回收 SRC（S1 SRC-S3 SRC）。

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

²  客户可根据方法验证结果确定日常检测复孔数及是否设置加标回收。

（二）显色：

1.        提前 20 分钟将 TMB 显色液置于室温条件下平衡。

2.        将上述板子用 1×缓冲液洗板，340 μL/孔，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干如此重复洗板 3 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。

3.        取合适体积的 TMB 显色液于加样槽中，用多通道移液器迅速将 TMB 显色液 100 μL/孔加入上述微孔板中，于室温避光温育 15 分钟。此步骤勿用封板膜密封。

（三）终止

1.       取合适体积的终止液于加样槽中，用多通道移液器迅速将终止液 50 μL/孔加入上述微孔板中。

备注：加入顺序需同显色液加入顺序一致，加样时吸头应悬空，避免接触微孔板中溶液，切勿产生气泡。

2.       终止后室温避光静置 5 分钟后读数。

（四）测读

1.    设定酶标仪波长 450 nm 和 620-650 nm（620-650 nm 区间内单一波长均可），测定各孔 OD 值。测定时不可覆盖封板膜或盖子。

备注：若酶标仪没有配备长波长时，可以仅设定 450 nm 波长，但是需确保微孔板孔底干净，无指纹或刮痕。

四、结果计算与判断

（一）结果计算：

1.        各孔 OD450 nm 数值需减去各自孔的长波长 OD 值。若酶标仪没有配备长波长时，可以省去此步骤。

2.        各校准点和样品的 OD 值分别减去阴性对照的 OD 值后，重复孔取均值。

3.        以校准点浓度值和 OD 值进行四参数拟合，获得校准曲线方程。将样品的平均 OD 值带入方程计算得到样品浓度，该浓度需乘以稀释倍数得到样品的实际浓度。

4.        标曲的拟合软件可以用酶标仪自带的软件。如无，则建议采用专业的标曲制作软件，如 Curve Expert，ELISA Calc 等。

（二）结果判断 ：

1．对于吸光度值超出校准品 ST1 的样品，可用稀释液稀释适宜倍数后再行测定，样品中抗原浓度值为稀释后测定值×稀释倍数。若同时设置在该稀释度下的适宜加标样品，回收率符合相应法规的方法学验证要求。

（三）检测方法的局限性：

1.       本品仅适用于研究用途，不用于临床诊断。

2.       本品仅适用于生物制品下游纯化工艺中重组胰蛋白酶类似物的定量测定。

3.       样品 pH 值应在 6.5～8.5 间，过低或过高的 pH 值可能会造成测量值异常。

（四）性能参数：

1．线性与校准范围：0.16-10.24 ng/ mL，线性相关系数 R2>0.990。

2.       最低定量限 LLOQ：0.16 ng/ mL。

3.       典型校准曲线如下图：

图 4 典型校准曲线

4.       特异性：与 MDCK、Vero、HEK293、SF9、E.coli 宿主蛋白和毕赤酵母宿主蛋白无交叉反应，与重组人胰蛋白酶、重组牛胰蛋白酶和重组猪胰蛋白酶无交叉反应。

n  重要事项提醒

试剂盒使用人员需经过培训，合格后方可使用。为了获得满意的检测结果，请您务必事先留意如下几点事项：

² 所有的试剂配制务必使用无菌一次性的吸头、试管和加样槽等，切勿混用。避免微量移液器吸头连接部分的污染，建议每次实验前后用 75 %酒精擦拭。规范移液操作，严禁液体倒吸到移液器，或未去掉吸头时横放在桌上。

²  校准品和样品的稀释混匀要轻柔充分，勿产生大量泡沫。

²  终止液为酸性溶液，在使用中注意眼睛、面部、手和衣服的防护。

²  不同批次试剂盒不建议混用。

²  配制缓冲液所用水需为无菌水或新鲜制备的超纯水，水温不得超过 37 ℃。

²  加样时注意不要有气泡，可轻轻晃动混匀。在上机检测前若有气泡存在，需用干净的 10 μL 吸头或针头等戳破，注意不要吸走孔内液体，导致结果误差大。

²  在孵育反应时需给酶标板覆膜，防止样品蒸发。

²  倒去缓冲液后应马上加后续溶液，勿让酶标孔处于干燥状态，以防影响试剂盒检测性能。

²  不用的酶标板条需用试剂盒附带的自封铝箔袋避光保存，以免被其他样品污染，导致试剂盒报废。

²  校准品配制、样品稀释等务必精确，配制时最小的取样量不要小于 5 μL，防止结果出现较大的误差。

²  重组胰蛋白酶类似物酶标抗体（100×）请在使用前快速离心，将管盖中残留的试剂甩到管底，防止试剂的污染和损失。

²  已稀释到工作浓度的校准品、重组胰蛋白酶类似物酶标抗体等因无法保证其稳定性，不建议再次重复使用。

²  显色液应是无色透明液体。吸取时务必更换干净的吸头，防止 HRP 污染。如发现已有淡蓝色，请弃用。

²  由于叠氮钠能抑制 HRP 活性，对检测结果有很大影响，因此样品中不能添加叠氮钠。

n  常见问题分析

若实验结果出现异常，请及时对未使用的酶标板和试剂进行妥善保管，对显色的酶标板实验结果拍照，保留实验原始数据。联系我司技术支持为您解决问题。以下常见的异常现象及解决方法供您参考：

n  参考文献

l  中国药典（2020）生物制品通则《生物制品生产用原材料及辅料质量控制》。

l  YY/T 1183-2010 酶联免疫吸附法检测试剂（盒）。

生效日期：    2023 年 07 月 18 日