MycoSHENTEK^®支原体DNA检测试剂盒（2G）与MycoSHENTEK^®支原体DNA提取纯化试剂盒（2G）配套使用，定性检测主细胞库、工作细胞库、病毒种子批以及细胞制品中是否有支原体、螺原体、无胆甾原体污染，参照EP 2.6.7和JP XVII 支原体检测相关要求进行验证，检测限为10CFU/mL。

n  试剂盒简介

MycoSHENTEK^®支原体 DNA 检测试剂盒（2G）与 MycoSHENTEK^®支原体 DNA提取纯化试剂盒（2G）配套使用，定性检测主细胞库、工作细胞库、病毒种子批以及细胞制品中是否有支原体、螺原体、无胆甾原体污染，参照 EP 2.6.7 和 JP XVIII 支原体检测相关要求进行验证，检测限为 10 CFU/mL。

本试剂盒利用荧光探针法 qPCR 技术，可定性检测约 200 种支原体、螺原体、无胆甾原体 DNA；经过多种支原体、非支原体和常见工程细胞 DNA 检测，特异性强；本试剂盒含 dUTP，可使用 UNG 酶系统以预防污染，有效避免假阳性结果的出现。

内部质控（IC）（2G）可在 PCR 扩增反应阶段加入，以判断待检样品对扩增反应是否存在抑制，防止假阴性结果的产生；也可在样品提取阶段加入，以评估提取效果。

n  试剂盒组分

* 内部质控（IC）（2G）、阳性质控（PC）（2G）分别使用 600 μL、500 μL DNA稀释液复溶。n  规格

50 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于以下机型，使用前需验证检测灵敏度）

1.         SHENTEK-96S

2.         7500 Real-Time PCR System

3.         CFX96 定量 PCR 系统

4.         Roche LightCycler 480 Ⅱ

n  实验所需但试剂盒中未含材料

1.   1.5 mL 或 2.0 mL 无菌低吸附离心管

2.   八联管或 96 孔 qPCR 板

3.   1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

4.   75%酒精

5.   UNG 酶（确定使用前建议验证酶效果）

n  相关设备

1.  超净台或生物安全柜

2.  迷你离心机

3.  微孔板离心机

4.  漩涡振荡器

5.  荧光定量 PCR 仪

6.  1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n 操作过程

一、实验前准备

1.       穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.       工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。

3.       将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2~8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

二、qPCR 反应液的准备

1．根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，一般做 2 个重复孔。

反应孔数 =（1 个阳性质控 PC + 1 个无模板对照 NTC + 1 个阴性对照样品NCS +1 个阳性对照样品（PCS）+ N 个待测样品）× 2 

2．根据反应孔数计算所需的 MIX 总量：

MIX =（反应孔数+2）× 10 μL（含有 2 孔的损失量）

3．各试剂根据表 2 所示准备 qPCR MIX：

* 若样品提取时已加入 IC，则配制 MIX 时应根据表 2 使用等体积的 DNA 稀释液代替 IC。

三、加样

1.    将所有溶液振荡混匀后根据表 3 所示加样，排版方式可参考表 4：

*    加样完成后体积为 30 μL /孔。

*    该示例表示的是检测 1 个阳性质控 PC、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性对照样品 NCS、1 个阳性对照样品 PCS、8 个待测样品。每个检测做 2 个重复孔。

*    实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.    将八联管用配套管盖盖紧或 96 孔版用光学膜封闭，置于 PCR 管振荡混合仪中振荡混匀，短时间快速离心 10 秒后放入 qPCR 仪。

四、qPCR 程序参数设置

1、以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1） 点击“实验向导”。

2） “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3） 选择步骤  2：选择项目中的“支原体检测-2G”程序。

4） 实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

2、其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1） 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2） 创建新检测探针，命名为“支原体检测-2G”，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建 VIC 探针，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。

3） 设置三步法反应程序：

25℃ UNG 酶 10 分钟；

95℃预变性 10 分钟；

95℃ 15 秒，62℃ 30 秒，72℃ 1 分 30 秒（读取荧光），45 个循环；反应体积 30 μL。

五、结果分析

1、以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1） “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将 NTC 孔的样品类型设置为无模板对照，PC 孔设置为阳性对照，NCS 孔设置为阴性对照，待测样品孔设置为待测样品。

2） 在“实验分析”页面点击， 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值。

2、以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。

1） 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2） 在Results 的Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的Task 一栏设置为NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔、PCS 孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S、PCS，之后点击。 3） 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品、PCS 的检测值。

 上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

六、判定标准

1.        PC、NTC、NCS、PCS 检测结果参考表 5：

*质控标准应基于实验室验证数据，可从满足检测限要求考虑。

2.        待测样品检测结果判定参考表 6：

*  VIC 信号如果有抑制，需重测或对样品进行合适处理消除抑制因子。

 如遇特殊样品或其他异常现象，结果难以判定，可联系湖州申科，咨询具体解决方案。

修订日期：2023 年 05 月 06 日

生效日期：2023 年 05 月 10 日