本试剂盒用于提取纯化细胞基质中微量分枝杆菌DNA，与 MycoSHENTEK®分枝杆菌DNA检测试剂盒配套使用。

本试剂盒可以进行手动操作，也可以通过rDNApurifyTM和rHCDpurifyTM实现样本的自动化处理。

n  试剂盒简介

MycoSHENTEK^®分枝杆菌 DNA 提取纯化试剂盒（磁珠法）用于提取纯化生物制品中微量分枝杆菌 DNA，与 MycoSHENTEK^®分枝杆菌 DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）配套使用。

对于样品体积小于 400 μL 的样品，可以直接使用本试剂盒进行提取；对于需要增加取样体积以提高检测灵敏度的，建议通过离心的方法对样品进行浓缩至终体积为 100-400 μL 后，再使用本试剂盒进行分枝杆菌 DNA 的提取和纯化。

本试剂盒可以采用手动操作，也可以通过 rHCDpurify^®实现样品的自动处理。

n  试剂盒组分

n  规格

50 Extractions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 无水乙醇（分析纯）

Ø 100%异丙醇（分析纯）

Ø 阳性质控样品，联系本公司订购（分枝杆菌阳性对照品，货号 1503609）

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附滤芯枪头

Ø 1.5 或 2.0 mL，50 mL 无菌低吸附离心管

Ø PCR 八联管或 96 孔板，相应管盖或覆膜

n  相关设备

Ø 磁性分离架和 rHCDpurify^®前处理系统

Ø 迷你离心机

Ø 漩涡振荡器

Ø 恒温金属浴

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

Ø 生物安全柜或洁净工作台

Ø 荧光定量 PCR 仪

Ø 96 孔微孔板混匀仪

n  实验操作流程

一、试剂、仪器准备

开启新试剂盒时需完成以下工作：

Ø 在新开启的洗涤液 A 中加入 20 mL 的无水乙醇。

Ø 在干净的试剂瓶中用无水乙醇和灭菌超纯水配制  70%乙醇溶液，标记为洗涤液B。

Ø 配制后的洗涤液应密封，室温保存，防止乙醇挥发（注意使用效期）。每次实验前需预先完成以下工作：

Ø 准备好 100%的异丙醇。

Ø 开启恒温金属浴，设置温度为 55 ℃和 70 ℃。

Ø 使用前若发现裂解液、结合液、预处理液出现结晶或沉淀，应 37 ℃水浴，待完全溶解后，振荡混匀。

Ø 使用前应提前将磁珠置于室温环境下平衡 10 分钟，使用前涡旋振荡 10 秒混匀。

二、样品处理

u  待测样品处理操作流程如下：

其它基质样品可咨询湖州申科技术支持！

根据样品类型选择下述的样品处理步骤：

u   无细胞样品

1.        加入预处理液（样品与预处理液的体积比为  20:1），涡旋振荡混匀。

2.        若样品体积≤400 μL，则可不做浓缩；若样品体积＞400 μL，则需 16000×g离心 15 分钟，使用移液器移去上清，使剩余体积≤400 μL。

3.        加入 10 μL 5M NaCl，10 μL IC，涡旋振荡 10 秒，快速离心 3 秒。

u   细胞样品

1.        若样品体积≤400 μL，则可不做浓缩；若样品体积＞400 μL，则 70-75×g 离心 5 分钟，使用移液器移去部分上清，使剩余体积≤400 μL。

2.        将细胞充分重悬混匀后加入 MB 细胞裂解液（样品与细胞裂解液的体积比为10:1），涡旋振荡 10 秒，快速离心 3 秒，此时开始计时。

3.        加入预处理液（样品与预处理液的体积比为  20:1），涡旋振荡混匀。

4.        5 分钟后，450×g 离心 10-15 分钟沉淀细胞碎片，使用移液器尽可能多的吸取上清转移入新的离心管，但不要吸到沉淀物。

5.        加入 10 μL 5M NaCl，10 μL IC，涡旋振荡 10 秒，快速离心 3 秒。

u  对照样品处理

Ø 阴性对照样品（NCS）

1.        取 100 - 400 μL 稀释液（体积可与待测样品体积保持一致）。

2.        加入预处理液（样品与预处理液的体积比为  20:1），涡旋振荡混匀。

3.        加入 10 μL 5M NaCl，10 μLIC，涡旋振荡 10 秒，快速离心 3 秒。

Ø 阳性对照样品（PCS）

1.        取 1 管分枝杆菌阳性对照品，快速离心 3 秒，加入稀释液或样品基质，涡旋振荡 10 秒，快速离心 3 秒（总体积可与待测样品体积保持一致）。

2.        加入预处理液（样品与预处理液的体积比为  20:1），涡旋振荡混匀。

3.        加入 10 μL 5M NaCl，10 μLIC，涡旋振荡 10 秒，快速离心 3 秒。

三、样品消化

1.        在上述各管样品中，加入 20 μL 蛋白酶 K，振荡混匀。

2.        再在上述各管中加入 100 μL 裂解液，振荡混匀后，55 ℃ 孵育 1 小时。为了使样品消化更加完全，需要在温育至 30 分钟左右时再次进行涡旋振荡混匀后继续孵育）。

注意样品消化后需尽快进行下述的 DNA 提取实验！四、DNA 提取

（一）操作过程（手工操作）

u  结合

1.  将磁珠置于室温环境下 10 分钟，振荡混匀。

2. 将样品快速离心 3 秒，加入 200 μL 结合液，200 μL 异丙醇，50 μL 磁珠。 

如果样品较多，每次加入磁珠过程中应再次充分振荡磁珠混匀，以保证每次加入的磁珠量的一致性。

3.  将装有全部混合物的离心管置于漩涡振荡器上振荡 5 分钟，快速离心 3 秒后静置于磁性分离架上。

快速离心的目的在于将附着在离心管盖和壁上的混合物甩至管底。

4. 待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清。 

等待磁珠完全分离的时间约为 3-5 分钟。

去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。

u  洗涤

1.        从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入 700 μL 洗涤液 A，振荡 10 秒使磁珠和洗涤液 A 混匀；快速离心 3 秒后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 1 次磁珠洗涤。

2.        从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入 700 μL 洗涤液 B，振荡 40 秒使磁珠和洗涤液 B 混匀；快速离心 3 秒后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 2 次磁珠洗涤。

3.        为保证液体充分移除，可将离心管再次快速离心 3 秒，置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，用 10 μL 枪头小心的将残余液体吸除干净。

去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。

4.        从磁性分离架上取下离心管，打开管盖在室温下干燥 30 秒-3 分钟，除去残留的乙醇。

干燥时间不可过长，室温较高或空气干燥的环境下可以适当缩短干燥时间，残留乙醇会影响下一步的检测反应。

u  洗脱

1.        沿离心管壁加入 50 μL 洗脱液，用漩涡振荡器轻微振荡 10 秒使磁珠和洗脱液混匀，70 ℃ 孵育 7 分钟，孵育过程中可再次振荡混匀 2-3 次。

振荡时不要将磁珠和洗脱液振到管盖上。

洗脱时应使洗脱液与磁珠充分混合均匀，避免磁珠附着于离心管盖和壁上导致未能充分混匀。

2.        孵育完成后，将离心管快速离心 3 秒，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中。

3.        将上一步获得的离心管快速离心 3 秒，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头再次转移溶液到干净离心管，所得即为样品纯化液。

收集洗脱液时，应将离心管内溶液转移完全，保证检测时所需 40 μL 的量。

（二）操作过程（rHCDpurify^®前处理系统）

u  提取准备

按照下述 96 深孔板排布预先加入相应溶液：

其中：

第 1 或 7 列：结合液 200 μL/孔，异丙醇 200 μL/孔，消化后的全部样品

第 2 或 8 列：洗涤液 A 700 μL/孔

第 3 或 9 列：洗涤液 B 700 μL/孔

第 4 或 10 列：磁珠 50 μL/孔

第 5 或 11 列：洗脱液 65 μL/孔

样品可在其他试剂全部加完后再加。

u  程序启动

1.        电源键打开—点击“登录”输入账号及密码—进入主界面。

2.       75%酒精棉球擦拭仪器内壁—点击“紫外灯”—选择“15 分钟”。  此步骤可在提取准备操作之前进行。

3.        将加好样的 96 深孔板放入仪器中固定位置，并把塑料套管插入磁头对应位置。

4.        点击“运行”—选择“Myco-601”程序—扫描试剂盒上二维码—仪器运行。

5.    程序结束，发出“嘀嘀”声，立即取出深孔板，将样品纯化液全部转移到新的离心管内。

注意要点

1.        建议将实验室内部进行分区，分为阴性区（阴性对照样品处理、PCR 试剂的配制、阴性模板加样）、阳性区（样品操作）、扩增区等，做好明显的标识。每个区域配备独立的设备、试剂及耗材，不得交叉使用。实验试剂、待测样品、PCR 产物应分开存放，不应放于同处。减少在实验区内不必要的走动，以降低污染发生概率。

2.        实验开始前确保实验室环境温度不低于 22 ℃。

3.        实验过程中选择最合适尺寸的手套并及时更换，在不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套，以避免不同实验区域交叉污染。

4.        装有试剂的离心管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或移液枪的风险；谨慎开关反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。

5.        使用过的枪头及废液必须经过消毒液浸泡消毒后，在远离实验室的场所丢弃或统一处理。

6.        PCR 扩增完成后，需戴上一次性手套将 PCR 管取出，观察管盖是否紧闭，管壁有否破裂，确保产物没有外漏，之后丢弃在指定处，严禁开盖。

7.        在磁性分离架上分离磁珠时，过程中可缓慢旋转离心管，加速磁珠聚集。

8.        DNA 洗涤和洗脱操作时，每次振荡混匀后，都应该瞬时离心，以保证没有磁珠或液体附着于离心管盖或管壁上。

9.        在去除乙醇干燥时，观察磁珠状态，勿让磁珠太干，以免洗脱时不完全溶解。

10.    请尽量在完成样品纯化处理当天进行后续的 DNA 检测，以保证检测结果的准确性。

11.    rHCDpurify 程序启动前，检查 96 深孔板和套管是否固定好。

12.    rHCDpurify 仪器工作前及完成后需要紫外灭菌至少 15 分钟，并使用 75%酒精棉球将仪器内壁擦拭干净。且两次提取实验间隔至少为 30 分钟。

13.    rHCDpurify 程序运行完毕后，需立即取出 96 深孔板并将洗脱液转移至新的离心管。 96 深孔板第 5 或第 11 列壁上可能会出现冷凝水珠，该现象不会影响提取效果，只需将底部洗脱液转移出来即可，且保证多于 40 μL，确保检测时所需。

修订日期：2023 年 05 月 16 日

生效日期：2023 年 06 月 01 日