n  试剂盒简介

MycoSHENTEK^® 分枝杆菌 DNA 检测试剂盒用于定性检测细胞、细胞制品、疫苗等产品中是否有分枝杆菌污染；与 MycoSHENTEK^®分枝杆菌 DNA 提取纯化试剂盒配套使用。

本试剂盒利用荧光探针法 qPCR 技术，定性检测样品中分枝杆菌 DNA，涵盖 100 多种分枝杆菌 DNA 序列；检测限为 100-10CFU；经过多种分枝杆菌、非分枝杆菌和常见工程细胞 DNA 检测，特异性强。本试剂盒含 dUTP，可使用 UNG 酶系统以预防污染，有效避免假阳性结果的出现。

内部质控（IC）可在 PCR 扩增反应阶段加入，以判断待检样品对扩增反应是否存在抑制，防止假阴性结果的产生；也可在样品提取阶段加入，以评估提取效果。

n  试剂盒组分

n  规格

50 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于以下机型，使用前需验证检测灵敏度）

Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

Ø 7500 Real-Time PCR System

Ø CFX96 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 1.5 mL 或 2.0 mL 无菌低吸附离心管

Ø 96 孔 qPCR 板或八联管

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

Ø 75%酒精

Ø UNG 酶（确定使用前建议验证酶效果）

n  相关设备

Ø 超净台或生物安全柜

Ø 迷你离心机

Ø 漩涡振荡器

Ø 荧光定量 PCR 仪

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  操作过程

v  实验前的准备

1.       穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.       工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 min，喷洒 75%酒精并擦干。

3.       将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至冰上或 2-8 ℃条件下融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

v  qPCR 反应液的准备

1.       根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，一般做 2 个重复孔。

反应孔数=（1 个阳性质控 PC+1 个无模板对照 NTC+1 个阴性对照样品 NCS+1 个阳性对照样品 PCS+N 个待测样品）× 2

2.       根据反应孔数计算所需的 MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：MIX =（反应孔数+2）× 10 μL

3.       各试剂放在冰上或 2-8 ℃条件下融化，并根据表 2 所示准备 qPCR MIX：

 若样品提取时已加入 IC，则配制 MIX 时应根据表 2 使用等体积的 DNA 稀释液代替 IC。

v  加样

1.    将所有溶液在冰上溶解，轻微振荡混匀后根据表 3 所示加样，排版方式可参考表 4：

该示例表示的是检测 1 个阳性质控 PC、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性对照样品NCS、1 个阳性对照样品 PCS、8 个待测样品。每个检测做 2 个重复孔。  

实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.    将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。

v  qPCR 程序设置

² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.    点击“实验向导”。

2.    “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3.    选择步骤  2：选择项目中的“分枝杆菌检测”程序。

4.    “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

²  其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.    创建 FAM 探针，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建 VIC 探针，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；选择检测参比荧光为 ROX（可选择）。

2.    设置反应程序：25 ℃ UNG 酶作用 10 min；95 ℃预变性 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s（读取荧光），45 个循环；反应体积 30 μL。

v  qPCR 结果分析

²  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.       待测样品、阳性质控 PC、阳性对照样品 PCS 和阴性质控样品 NCS 将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

2.       在“实验分析”页面点击。

3.       在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、阳性质控 PC、阳性对照样品 PCS 以及待测样品的 Ct 值。

²  以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。

1.       在 Results 的 Amplification Plot 面板中，选择 Manual Ct，将 Threshold 设置为 0.02，选择 Auto Baseline，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.       在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阳性质控 PC 孔、阴性质控样品 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 PC、NTC、NCS，之后点击。

阈值线设定应基于实验室验证数据，可从满足检测限要求考虑。

结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。例如 Bio-Rad 公司 CFX96 型号定量 PCR 仪，软件版本 CFX Manager 2.0，阈值线可设置为 800。

3.       PC、NTC、NCS、PCS 检测结果应为：

质控标准应基于实验室验证数据，可从满足检测限要求考虑。

4.       待测样品检测结果判定：

·VIC 信号如果有抑制，需重测或对样品进行合适处理消除抑制因子。

·如遇特殊样品或其他异常现象，结果难以判定，可联系湖州申科，咨询具体解决方案。

修订日期：2023 年 03 月 07 日