产品信息：

• 检测类型：定性检测

• 产品规格：50测试

• 检测时间：4-4.5h

• 适用样品类型：主细胞库、工作细胞库等细胞培养物；疫苗、细胞治疗产品等生物制品

• 广谱性：约92%的已知真菌物种，匹配近5千种（或亚种）真菌DNA序列

• 检测限：50-100CFU

• 专属性：与Vero、HEK293T、CHO等常见工程细胞及细菌、支原体等菌种无交叉反应。

• 耐用性：反应体系不受样品基质/反应温度/反应体积微小变化影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Roche LightCycler480

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：检测下限低至50-100CFU，满足实际检测需求。

• 设计可靠：包含内部质控和阴阳质控有效完整监控提取检测过程。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。

n  试剂盒简介

MicroSHENTEK^® 真菌 DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）与 MicroSHENTEK^®真菌&细菌 DNA 提取纯化试剂盒（磁珠法）配套使用，定性检测细胞、细胞制品、疫苗等产品中是否有真菌污染。试剂盒参照中国药典 qPCR 方法检测相关要求进行验证，检测限为不大于 35 CFU/反应。

本试剂盒利用荧光探针法 qPCR 技术，可定性检测样品中是否存在真菌 DNA，可覆盖约 92%的已知真菌物种，匹配近 5 千种（或亚种）真菌 DNA 序列；通过多种真菌、非真菌和常见工程细胞物种 DNA 检测，广谱性好，特异性强。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于诊断。

n  试剂盒组分

n   规格

50 Reactions。

n   有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n   适用机型（包括但不限于以下机型，使用前需用户验证检测灵敏度）

1.        SHENTEK-96S

2.        Roche LightCycler 480 Ⅱ

n   实验所需但试剂盒中未含材料

1.        1.5 或 2.0 mL 无菌低吸附离心管

2.        八联管及管盖

3.        1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

4.        75 %酒精

5.        UNG 酶（确定使用前建议验证酶效果）

6.        医疗用一次性利器盒

7.        核酸清除剂，联系本公司订购

n   相关设备

1.        单人桌面无菌超净工作台（SSD-1）

2.        迷你离心机

3.        漩涡振荡器

4.        荧光定量 PCR 仪

5.        1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  实验操作流程

图 1 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         穿戴适当的工作及保护服，至少穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性反穿衣、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子和医用口罩。

2.         工作区及环境采取适当地消毒，去除残留核酸。至少工作台面、移液枪、枪头、八联管及管盖、离心管及离心管架紫外照射时长不少于 1 小时，使用核酸清除剂、75%酒精全面擦拭消毒。

3.         将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2-8 ℃区域融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

4.         参考《MicroSHENTEK®真菌&细菌 DNA 提取纯化试剂盒（磁珠法）说明书》要求进行分区：分为阴性区、待测样品区、阳性区。分别在各区域单人桌面无菌超净工作台（SSD-1）中操作。

阴性区：试剂配制区域&NCS、NTC 阴性质控加样区域；待测样品区：待测样品加样区域；

阳性区：PCS、PC  阳性质控加样区域。

（二）qPCR 反应液准备：

1.         根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，一般做 2 个重复孔。反应孔数 =（1 个阳性质控 PC + 1 个无模板对照 NTC + 1 个阴性对照样品 NCS + 1 个阳性对照样品 PCS + N个待测样品）× 2

2.         根据反应孔数计算所需的 qPCR MIX 总量：qPCR MIX 总量 =（反应孔数+2）× 10 μL（含有 2 孔的损失量）

3.         各试剂根据表 2 所示准备 qPCR MIX：

*   qPCR MIX 配制应在阴性区无菌超净工作台中操作。

**若样品提取时已加入 IC，则配制 MIX 时应根据表 2 使用等体积的 DNA 稀释液代替 IC。

二、操作步骤

（一）加样

1.    将所有溶液振荡混匀后根据表 3 所示加样，排版方式可参考表 4：表 3. 各反应孔加样示例

²  该示例表示的是检测 1 个阳性质控 PC、1 个无模板对照NTC、1 个阴性对照样品 NCS、1 个阳性对照样品 PCS、8 个待测样品。每个检测做 2个重复孔。

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行排版加样。

*严格注意操作顺序：应当依次在阴性区完成 NTC 和 NCS 加样及封闭，待测样品区完成待测样品加样及封闭，阳性区完成 PC 和 PCS 加样及封闭。

（二）程序参数设置

将八联管用管盖封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 秒后放入 qPCR仪，接着进行 qPCR 程序设置：

l  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.         点击“实验向导”。

2.         “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3.         选择步骤 2：选择项目中的“Micro-Fun&Bac”程序。

4.         “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

l  其他荧光定量 qPCR 系统推荐程序设置如下：

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.  创建新检测探针，命名为“真菌检测”，选择报告荧光基团为 FAM；创建 VIC 探针，选择报告荧光基团为 VIC。

3.    设置三步法反应程序：

25 ℃ UNG 酶作用 10 分钟；

95 ℃预变性 10 分钟；

95 ℃ 15 秒，55 ℃ 30 秒，72 ℃ 1 分钟（读取荧光），45 个循环；

反应体积 30 μL。

三、结果计算与判断

（一）结果计算

l  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.   “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将 NTC 孔的样品类型设置为无模板对照，PC 孔、PCS 孔设置为阳性对照，NCS 孔设置为阴性对照，待测样品孔设置为待测样品。

2.   在“实验分析”页面点击， 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性对照样品 NCS、阳性对照样品 PCS、阳性质控 PC、待测样品的检测值。

l  以 Roche LightCycler 480 Ⅱ、软件版本 1.5 为例。

1.   在 Subset Editor 的左下方点击“+”选项，然后选择相对应上样孔，确定后点击右下方的“Apply”选项保存。

2.       在 Sample Editor 的 Sample Name 一栏中命名相对应上样孔的名称NTC、NCS、S、PCS、PC。

3.       在 Analysis 中选择 Abs Quant/Fit Points 分析类型，点击“√”选项进入界面，在 Noise Band 界面下方选择 Noiseband(Fluoresc)，通过手动改变 Noise Band 使阴阳性样品区分（此时 Threshold 将与 Noise Band 保持一致），然后点击左下方“Calculate”选项，进行 Ct 值读取。

上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定。

（二）结果判定

1.          PC、NTC、NCS、PCS 检测结果应为：

*若阴性质控 Ct 值<39.00 但 Ct 值大于 50-100 CFU 菌株 2 个循环及以上，则可判定阴性质控符合要求。

*阴阳性质控符合要求时，若待测样品 Ct 值<39.00 但 Ct 值大于 50-100 CFU 菌株 2 个循环及以上，也可判定为未检出。

*如遇特殊样品或其他异常现象，结果难以判定，可联系湖州申科，咨询具体解决方案。

修订日期：2024 年 12 月 24 日

生效日期：2024 年 12 月 31 日