本试剂盒用于提取纯化生物样品中的微量真菌&细菌DNA，适用样品包括主细胞库、工作细胞库等细胞培养物，疫苗、细胞治疗产品等生物制品，同时对高浓度细胞（不大于10⁶ 个细胞）类复杂基质生物制品均适用。该产品与MicroSHENTEK^® 细菌DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）和MicroSHENTEK^® 真菌DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）配套使用。试剂盒参照中国药典qPCR方法检测相关要求进行验证，若使用推荐的体系提取性能可达50-100 CFU/管，搭配对应检测试剂盒检测限不大于35 CFU/反应。

本试剂盒通过rHCD purify^®前处理系统实现样品的自动化处理。

MicroSHENTEK^® 真菌&细菌 DNA 提取纯化试剂盒（磁珠法）用于提取纯化生物样品中的微量真菌&细菌 DNA，适用样品包括主细胞库、工作细胞库等细胞培养物，疫苗、细胞治疗产品等生物制品，同时对高浓度细胞（不大于 10⁶ 个细胞）类复杂基质生物制品均适用。该产品与 MicroSHENTEK^® 细菌 DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）和 MicroSHENTEK^® 真菌 DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）配套使用。试剂盒参照中国药典 qPCR 方法检测相关要求进行验证，若使用推荐的体系提取性能可达 50-100 CFU/管，搭配对应检测试剂盒检测限不大于 35 CFU/反应。

本试剂盒通过 rHCD purify^®前处理系统实现样品的自动化处理。

n   试剂盒组分

n   规格

50 Extractions

n   有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n   实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 无菌超纯水

Ø 无水乙醇（分析纯）

Ø 100%异丙醇（分析纯）

Ø 75%酒精

Ø 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附滤芯枪头

Ø 1.5 mL，2.0 mL，50 mL 无菌低吸附离心管

Ø 真菌&细菌阳性菌株

Ø 医疗用一次性利器盒

Ø 核酸清除剂，联系本公司订购

n   相关设备

Ø 真菌细菌破壁仪（Lyse-S）

Ø 单人桌面无菌超净工作台（SSD-1）

Ø rHCDpurify^®前处理系统

Ø 迷你离心机

Ø 高速离心机

Ø 漩涡振荡器

Ø 恒温金属浴

Ø 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  实验操作流程

一、实验前准备

u  实验分区：

根据样品类型进行分区：分为阴性区、待测样品区、阳性区。分别在各区域单人桌面无菌超净工作台（SSD-1）中操作

阴性区：NCS 阴性质控处理加样区域&试剂加样区域；待测样品区：待测样品处理加样区域；

阳性区：PCS  阳性质控处理加样区域。

u  环境控制：

工作区及环境进行适当地消毒，去除残留核酸。至少使用核酸清除剂、75%酒精进行全方位擦拭消毒处理各区域超净工作台。

打开超净工作台紫外灯灭菌，保证照射时长不少于 1 小时；并打开各区域紫外设施灭菌，保证照射时长不少于 30 分钟。

u  试剂准备：

注意：所有试剂稀释和加样均在阴性区操作！

Ø  根据使用体积将助沉剂Ⅰ用稀释液按 10 倍梯度稀释 100 倍，备用。

Ø  在新开启的洗涤液A 中加入 20 mL 的无水乙醇。

Ø  准备好 100%的异丙醇。

Ø  在干净的试剂瓶中用无水乙醇和灭菌超纯水配制 70%乙醇溶液，标记为洗涤液 B。

Ø  配制后的洗涤液应密封，室温保存，防止乙醇挥发（注意使用效期）。

Ø  使用前若发现裂解液、结合液出现结晶或沉淀，应 37 ℃水浴，待完全溶解后，振荡混匀。

Ø  使用前应提前将磁珠置于室温环境下平衡 10 分钟，使用前涡旋振荡 10 秒混匀。

u  设备准备：

Ø  开启恒温金属浴，设置温度为 55 ℃。

Ø  真菌细菌破壁仪：分别用核酸清除剂、75%酒精进行全方位擦拭消毒处理。

Ø  前处理提取仪：电源键打开—点击“登录”输入账号及密码—进入主界面。分别用核酸清除剂、75%酒精进行全方位擦拭消毒处理。处理后可提前插入塑料套管，紫外灭菌不少于 1 小时。

二、样品处理

u  待测样品处理操作流程如下：

备注：若用户样品为细胞基质，首先采用70-75 ×g，5 分钟离心处理，离心后吸取上清按照上述步骤操作。

其它基质样品可咨询湖州申科技术支持！

样品处理的详细步骤如下：

u  样品浓缩

 1）将样品等分为 2 份，1 份用于细菌提取，1 份用于真菌提取。分别采用 ≥16200×g，4 ℃离心 15-30 分钟，使用移液器移去上清，使剩余体积为 40-80 μL，后加入 400 μL 稀释液涡旋振荡混匀。

备注：离心时间的长短由样品初始体积决定，样品体积≥500 μL，推荐使用30 分钟离心。

u  样品准备

1） 将上述样品转移至样品处理管中。

2） 加入 5 μL 稀释后的助沉剂Ⅰ。

3） 用于真菌提取的样品加入 10 μL Fun 内部质控（IC）。

备注：Fun 内部质控（IC）试剂为MicroSHENTEK® 真菌DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）中组分。

u  破壁处理

1） 将样品处理管按照真菌细菌破壁仪（Lyse-S）说明书要求对称放置于仪器上，拧紧压盖螺母，关闭顶盖直至自动扣紧。

2） 选择自定义参数设置界面，根据提示设置速度、时间、循环数。推荐设置参数：5 米/秒，40 秒，1 循环条件下振荡处理。

u  样品离心

1） 将处理好的样品处理管于 ≥16200 ×g，4 ℃离心 ≥2 分钟，确保离心后的管内液体全部离心到底部，液面位置无明显泡沫存在。

2） 离心后将样品上清液在对应操作区全部吸出，并转移至新的 1.5 mL 离心管（避免吸到底部白色颗粒）。

u  对照样品处理

Ø  阴性对照样品（NCS）

  取与待测样品体积一致的稀释液，按照上述样品处理步骤进行处理。

Ø  阳性对照样品（PCS）

取真菌和细菌阳性菌株，分别加入稀释液或样品基质，推荐加入待测样品作为基质（总体积与待测样品体积保持一致），按照上述样品处理步骤进行处理。

三、样品消化

在所有样品中，加入 10 μL 5M NaCl、10 μL 蛋白酶 K、100 μL 裂解液，振荡混匀后，55 ℃孵育 40-60 分钟。

注意：为了使样品消化更加完全，推荐孵育至20-30 分钟左右时再次进行涡旋振荡混匀后继续孵育。总孵育时长请根据样品及基质情况在推荐范围内确定。样品消化后需尽快进行下述的DNA 提取实验！

四、DNA 提取

操作过程（rHCDpurify®前处理系统）

u   提取准备

预先准备两块 96 深孔板，并按照下述排布加入相应溶液：待测样品和 NCS 排布示意图（96 深孔板-1）

其中：

第 1 或 7 列：结合液 200 μL/孔，异丙醇 200-400 μL/孔，助沉剂 II 9 μL/孔，消化后的全部样品

第 2 或 8 列：洗涤液A 700 μL/孔

第 3 或 9 列：洗涤液B 700 μL/孔

第 4 或 10 列：磁珠 30 μL/孔

第 5 或 11 列：洗脱液 65 μL/孔

备注：PCS 样品和其他样品推荐按照上述排布示意图分别置于两块96 深孔板上进行提取。上述待测样品、NCS 和PCS 尾缀“-细菌”表示提取对应样品中的细菌；尾缀“-真菌”表示提取对应样品中的真菌。

u  程序启动

1.          将加好样的 96 深孔板快速放入仪器中固定位置（96 深孔板-1 放置仪器最右侧，96 深孔板-2 放置仪器最左侧），确认塑料套管已插入磁棒对应位置。

2.          点击“运行”—选择“Micro-633”程序—扫描试剂盒上二维码—仪器运行约 52 分钟。

3.          程序结束，发出“嘀嘀”声，立即取出深孔板，将样品纯化液按照样品类型全部转移到新的离心管内。

注意要点

1.        根据样品类型按照要求进行严格分区操作，每个区域配备独立的设备、试剂及耗材，不得交叉使用。实验试剂、待测样品、PCR 产物应分开存放，不应放于同处。减少在实验区内不必要的走动，以降低污染发生概率。

2.        实验过程中选择最合适尺寸的手套并及时更换，在不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套，以避免不同实验区域交叉污染。

3.        实验开始前确保实验室环境温度不低于 22 ℃，湿度不高于 70%。

4.        程序启动前，检查 96 深孔板和套管是否固定好。

5.        程序运行完毕后，需立即取出 96 深孔板并将洗脱液转移至新的离心管。96 深孔板第 5 或第 11 列壁上可能会出现冷凝水珠，该现象不会影响提取效果，只需将底部洗脱液转移出来即可，且保证多于 40 μL，确保检测时所需。

6.        建议完成样品纯化处理当天进行后续的 qPCR 检测，确保检测结果准确。

修订日期：2025 年 05 月 23 日

生效日期：2025 年 05 月 23 日