细菌内毒素能特异性地激活反应主剂中的C因子，活化的C因子激活B因子，活化的B因子进而激活凝固酶原，凝固酶水解反应中的显色底物，产生游离的pNA（对硝基苯胺）从而引起吸光度变化，根据动态检测溶液吸光度变化率对细菌内毒素浓度进行定量。

本产品用于定量测定人用和动物用注射药物、生物制品及医疗器械等样本中的细菌内毒素的含量。

n  试剂盒简介

细菌内毒素能特异性地激活反应主剂中的 C 因子，活化的 C 因子激活 B 因子，活化的 B 因子进而激活凝固酶原，凝固酶水解反应中的显色底物，产生游离的 pNA（对硝基苯胺）从而引起吸光度变化，根据动态检测溶液吸光度变化率对细菌内毒素浓度进行定量。

本产品用于定量测定人用和动物用注射药物、生物制品及医疗器械等样品中的细菌内毒素的含量。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于诊断。

n  试剂盒组分

n  包装规格

96T/盒

n  检测限

0.005-5 EU/mL

n  储存条件及有效期

2-8℃储存，规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用仪器

微孔板检测仪或带温浴、震板功能同时可进行动力学读数的酶标仪，所需波长 405nm。

n  检验方法

1.        内毒素限值的确定

药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

L=K/M

L 为供试品的细菌内毒素限值，一般以 EU / mL、EU / mg 或 EU / U (活性单位)表示； 

K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以 EU / (kg·h)表示，注射剂 K=5EU / (kg·h)，放射性药品注射剂 K=2.5 EU / (kg·h)，鞘内用注射剂 K=0.2 EU / (kg·h)； 

M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以 mL / (kg·h)、mg / (kg·h)或 U /(kg·h)表示，人体重按 60 kg 计算，人体表面积按 1.62 m² 计算。注射时间若不足 1 小时，

按1 小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027 即可转换为每千克体重剂量（M）。

2.        供试品溶液的制备

当供试品需要控制的内毒素限值（L）大于鲎试剂的灵敏度值时，需要用检查用水对供试品进行稀释，计算公式如下：MVD=cL/λ

MVD：供试品的最大有效稀释倍数；

L：供试品需控制的内毒素限值（EU/mL）

c：为供试品溶液的浓度。当 L 以 EU/mL 表示时，则 c 等于 1.0 mL/mL；L 以 EU/mg或 EU/U 表示时，c 的单位需为 mg/mL 或 U/mL。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则 MVD 取 1，可计算供试品的最小有效浓度：

c=λ/L

λ：为试剂盒的标示灵敏度（EU/mL），本产品灵敏度为 0.005 EU/mL。举例：

某供试品需要控制的内毒素限值为 1 EU/mL，使用灵敏度λ=0.005 EU/mL 的鲎试剂作为细菌内毒素检查，则 MVD=200 倍，即供试品最大可稀释 200 倍后进行检查。

3.        细菌内毒素标准品溶液制备

1）     溶解：取 R2 工作标准品 1 支，按标签所示使用 R3 检查用水复溶，置涡旋混匀器上混匀至少 10 min，得 5 EU/mL 细菌内毒素标准品溶液。

2）     稀释：内毒素梯度浓度 5、0.5、0.05、0.005 EU/mL，每稀释一步均应在涡旋混匀器上剧烈震荡 2 分钟。内毒素标准溶液配制可参考下表：

若稀释的内毒素溶液静置时间超过 10 分钟，用前须在涡旋混匀器上剧烈震荡 2 分钟，放置 4 小时以上的内毒素溶液应丢弃。

4.        阴性对照：为检查用水。

5.        主剂复溶：取主剂复溶液 2.6 mL 溶解反应主剂，振荡混匀，静置待用。

6.        实验操作

1)        在微孔板中分别加入 100 μL 标准品、阴性对照以及供试品溶液，至少 2 个复孔。

2)        向加有标准品、阴性对照以及供试品溶液的微孔中加入 100 μL 反应主剂溶液。

3)        检测前，微孔板震动 5-10 s。设定 Onset OD=0.02-0.1（起始点与终点 OD 的差值），在 37℃下，波长 405 nm 下进行检测 90 min，反应结束后得启动时间（T）。

7.        结果计算

1)        建立标准曲线

lgT=b lgC + a

其中：T 为启动时间，C 为内毒素的浓度，b 为直线斜率，a 为 Y 轴截距。

2)        根据标准曲线计算样品内毒素浓度。

注意：为保证检测结果准确性，检测时请在 5 min 内将反应主剂加入到待检测微孔板中。

n  供试品的干扰实验

当对新药或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，必须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变，或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，必须重新进行干扰试验；当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验。

步骤如下：

1.        选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。

2.        用供试品溶液配制浓度为λm 的内毒素溶液（即含λm 内毒素的供试品阳性对照），测量出该溶液的内毒素浓度，称为 Cs；

3.        测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度，称为 Ct；

4.        计算该试验条件下的回收率 R＝(Cs–Ct)/λm×100%；

5.        当 R 在 50%-200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

6.        当 R 在 50%-200%之外，需对供试品进行系列稀释或进行其它处理消除干扰，每一稀释溶液都重复步骤 2-4，直到内毒素的回收率 R 在 50%-200%之间。选择回收率 R 最接近 100%的稀释倍数进行内毒素检测。

(参见《中华人民共和国药典》细菌内毒素检查法)

n  注意事项

1.        本品仅用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止试剂以任何途径进入人体。

2.        试剂盒使用前仔细检查试剂盒是否破损和阅读产品说明书，发现错误和缺损禁止使用，以免影响测定结果。

3.        试剂盒中的成份可能会导致皮肤和眼睛疼痛，也可刺激黏膜和上呼吸道，应避免与皮肤接触，避免吸入和食入。

4.        实验操作应在无菌无热原的环境下，避免微生物病原体污染。

5.        供试品的 pH 值应在 6.0-8.0 之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液（内毒素浓度小于 0.005 EU/mL）、0.1 M 氢氧化钠或 0.1 M 盐酸调节。

6.        当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验，参见【供试品的干扰试验】。

n  参考文献

[1]    Levin J.The role of endotoxin in the extracellular coagulation of limulus blood[J]. Bull Johns Hopkins Hosp, 1964, 115.

[2]    Levin J,Bang FB.Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin[J].Thromb Diath Haemorrh. 1968 Mar 31;19(1):186-197.

生效日期：2024 年 04 月 17 日