n  试剂盒简介

SHENTEK^® PI-3 病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR 荧光探针法）与 SHENTEK^® 病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）配套使用，用于检测牛副流感病毒 3 型（Bovine Parainfluenza 3 Virus，PI-3）。适用于生物制品中对细胞库，病毒种子批和牛血清中的 PI-3 病毒污染进行快速检测。

本试剂盒利用荧光探针法 RT-qPCR 技术，检测灵敏度高，检测限 50 copies/反应。检测特异性强，与牛源病毒（BVDV、REO-3、BAV-3、BPV），工程细胞（CHO、VERO、 293T、MDCK、NS0、Sf9），工程菌（大肠杆菌、毕赤酵母）和牛、猪基因组无交叉反应干扰。

n  试剂盒组分

n  规格

50 Reactions。

n  有效

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于以下机型，使用前需验证检测灵敏度）

1.        SHENTEK-96S 定量 PCR 系统

2.        7500 Real-Time PCR System

3.        CFX96 定量 PCR 系统

4.        Roche LightCycler 480 Ⅱ

n  实验所需但试剂盒未含材料

1.        1.5 mL 或 2.0 mL 无菌 DNase/RNase-free 低吸附离心管

2.        96 孔 qPCR 板或八联管

3.        1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL DNase/RNase-free 低吸附带滤芯枪头

4.        病毒核酸提取试剂盒（货号：1506730）

5.        PI-3  阳性对照品，联系本公司订购

n  相关设备 

1.        生物安全柜

2.        迷你离心机

3.        漩涡振荡器

4.        荧光定量 PCR 仪

5.        1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  实验操作流程

图 1 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         穿戴实验服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.        有感染性病毒提取检测和有感染性病毒阳性对照品处理建议在P2 实验室和生物安全柜中进行。

3.        检测过程中严格使用无核酶的试剂和耗材。

4.        需要使用的试剂提前取出置于冰上融解并充分混匀。

（二）病毒核酸提取：

l 待测样品的病毒核酸提取

使用病毒核酸提取试剂盒（货号：1506730）对样品中的病毒核酸提取纯化。对于细胞基质和牛血清样品，参考病毒核酸提取试剂盒说明书里的细胞基质方法 2 流程进行病毒核酸提取。（具体步骤请参考病毒核酸提取试剂盒说明书）。

l 阳性对照品（PCS）

使用 PI-3 阳性对照品作为阳性对照 PCS，在提取阶段和同批待测样品一起进行相同的样品前处理，制备成 PCS 纯化液用于 RT-qPCR 检测。

l 阴性对照品（NCS）

使用样品基质溶液（或 RNase-Free H2O）作为阴性对照 NCS，在提取阶段和同批待测样品一起进行相同的样品前处理，制备成 NCS 纯化液用于RT-qPCR检测。

（三）RT-qPCR 反应液准备：

1.       根据所要检测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 2 个重复孔/样。反应孔数 =（1 个无模板对照 NTC + 1 个阴性质控样品 NCS+1 个阳性质控样品 PCS + N 个待测样品）×2

2.       MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需的 RT-qPCR MIX 总量。RT-qPCR MIX =（反应孔数 + 2）× 10μL（含有 2 孔的损失量）

3.       根据表 2 准备各试剂 RT-qPCR MIX 用量。

二、操作步骤

（一）加样

1.    将所有溶液振荡混匀后按表 3 和表 4 所示加样：

² 该示例表示的是检测 1 个阴性质控样品 NCS、1 个无模板对照 NTC、1个阳性质控样品 PCS、5 个待测样品。每个检测做 2 个重复孔。

² 实际检测时可根据样品多少，参照表 4 示例进行 96 孔板排版加样。

（二）程序参数设置

将八联管用配套管盖盖紧或 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 秒后放入 qPCR 仪，接着进行 RT-qPCR 程序设置：

l  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：

1.         点击“实验向导”。

2.         “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3.         选择步骤 2：选择项目中的“PI-3 病毒核酸检测”程序。

4.         “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

l  其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.         创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.        创建新检测探针，命名为“PI-3”，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建 VIC 探针，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。

3.        设置 RT- qPCR 反应程序： 50 ℃ 逆转录 15 分钟； 95 ℃ 预变性 30 秒；95 ℃ 15 秒，60 ℃ 1 分钟（读取荧光），45 个循环；反应体积 20 μL。

三、结果计算与判断

（一）结果计算

l  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：

1.        “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将 NTC 孔的样品类型设置为无模板对照，NCS 孔设置为阴性对照，待测样品孔设置为待测样品。

2.        在“实验分析”页面点击， 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值。

l  以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例：

1.        在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.        在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔、PCS 孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S、 PCS，之后点击。

3.         在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控 NCS、待测样品、PCS 的检测值。

          ·上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

（二）结果判断

1.         NTC、NCS、PCS 检测结果参考表 5：

 *质控标准应基于实验室验证数据，可从满足检测限要求考虑。

2.         待测样品检测结果判定参考表 6：

 * VIC 信号如果有抑制，需重测或对样品进行合适处理消除抑制因子。

                                                                                                                                                           生效日期：2023 年 05 月 29 日