本试剂盒与SHENTEK®病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）配套使用，用于检测呼肠孤病毒3型（Reovirus 3，REO-3）。适用于生物制品中对细胞库，病毒种子批和牛血清中的REO-3病毒污染进行快速检测。
n 试剂盒简介
SHENTEK® REO-3 病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR 荧光探针法）与 SHENTEK® 病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）配套使用，用于检测呼肠孤病毒 3 型（Reovirus 3，REO-3）。适用于生物制品中对细胞库，病毒种子批和牛血清中的 REO-3 病毒污染进行快速检测。
本试剂盒利用荧光探针法 RT-qPCR 技术，检测灵敏度高，最低检测限达到 50 copies/反应。检测特异性强，与牛源病毒（BVDV、PI-3、BAV-3、BPV），工程细胞（CHO、 VERO、293T、MDCK、NS0、Sf9），工程菌（大肠杆菌、毕赤酵母）和牛、猪基因组无交叉反应干扰。
n 试剂盒组分
50 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
1. SHENTEK-96S 定量 PCR 系统
2. 7500 Real-Time PCR System
3. CFX96 定量 PCR 系统
4. Roche LightCycler 480 Ⅱ
1. 1.5 mL 或 2.0 mL 无菌 DNase/RNase-free 低吸附离心管
2. 96 孔 qPCR 板或八联管
3. 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL DNase/RNase-free 低吸附带滤芯枪头
4. 病毒核酸提取试剂盒（货号：1506730）
5. REO-3 阳性对照品，联系本公司订购
1. 生物安全柜
2. 迷你离心机
3. 漩涡振荡器
4. 荧光定量 PCR 仪
5. 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 移液枪
图 1 操作流程示意图
1. 穿戴实验服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。
2. 有感染性病毒提取检测和有感染性病毒阳性对照品处理建议在P2 实验室和生物安全柜中进行。
3. 检测过程中严格使用无核酶的试剂和耗材。
4. 需要使用的试剂提前取出置于冰上融解并充分混匀。
1. 使用病毒核酸提取试剂盒（货号：1506730）对样品中的病毒核酸提取纯化。对于细胞基质样品，参考病毒核酸提取试剂盒说明书里的细胞基质方法 2 流程进行病毒核酸提取（具体步骤请参考病毒核酸提取试剂盒说明书）。
2. 待测样品提取纯化液在进行 RT-qPCR 检测前先进行热处理，95℃，3 分钟后，暂时保存于 4℃冰箱。
l 阳性对照品（PCS）
使用 REO-3 阳性对照品作为阳性对照 PCS，在提取阶段和同批待测样品一起进行相同的样品前处理，制备成 PCS 纯化液用于 RT-qPCR 检测。
l 阴性对照品（NCS)
使用样品基质溶液（或 RNase-Free H2O）作为阴性对照 NCS，在提取阶段和同批待测样品一起进行相同的样品前处理，制备成 NCS 纯化液用于RT-qPCR检测。
（三）RT-qPCR 反应液准备：
1. 根据所要检测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 2 个重复孔/样。反应孔数 =（1 个无模板对照 NTC + 1 个阴性质控样品 NCS+1 个阳性质控样品 PCS + N 个待测样品）×2
2. MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需的 RT-qPCR MIX 总量。RT-qPCR MIX =（反应孔数 + 2）× 10μL（含有 2 孔的损失量）
3. 根据表 2 准备各试剂 RT-qPCR MIX 用量。
1. 将所有溶液振荡混匀后按表 3 和表 4 所示加样：
² 该示例表示的是检测 1 个阴性质控样品 NCS、1 个无模板对照 NTC、1
个阳性质控样品 PCS、5 个待测样品。每个检测做 2 个重复孔。
² 实际检测时可根据样品多少，参照表 4 示例进行 96 孔板排版加样。
将八联管用配套管盖盖紧或 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 秒后放入 qPCR 仪，接着进行 RT-qPCR 程序设置：
l SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：
1. 点击“实验向导”。
2. “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。
3. 选择步骤 2：选择项目中的“REO-3 病毒检测”程序。
4. “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
l 其他定量 PCR 系统程序设置如下：
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，命名为“REO-3”，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建 VIC 探针，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。
3. 设置 RT- qPCR 反应程序： 50 ℃ 逆转录 15 分钟； 95 ℃ 预变性 30 秒；
反应体积 20 μL。
l 1、以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将 NTC 孔的样品类型设置为无模板对照，NCS 孔设置为阴性对照，待测样品孔设置为待测样品。
2. 在“实验分析”页面点击
， 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值。
l 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例：
1. 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔、PCS 孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S、 PCS，之后点击。
3. 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照
NTC、阴性质控 NCS、待测样品、PCS 的检测值。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用
的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
1. NTC、NCS、PCS 检测结果参考表 5：
表 5.质控结果分析
质控样品 | FAM 信号 | VIC 信号 |
NTC | 2 复孔Ct≥40 或扩增曲线无明显起峰 | 2 复孔 Ct<35>且有效的“S”型扩增 |
NCS | 2 复孔Ct≥40 或扩增曲线无明显起峰 | 2 复孔 Ct<35>且有效的“S”型扩增 |
PCS | 2 复孔 Ct<35>且有效的“S”型扩增 | 2 复孔 Ct<35>且有效的“S”型扩增 |
*质控标准应基于实验室验证数据，可从满足检测限要求考虑。
2. 待测样品检测结果判定参考表 6：
表 6.待测样品检测结果分析
FAM 信号 | VIC 信号 | 结果判断 |
2 复孔有 1 孔以上 Ct<40>且有效的“S”型扩增 | 2 复孔 Ct<40>且有效的“S”型扩增 | 阳性 |
2 复孔 Ct≥40 或扩增曲线无明显起峰 | 阳性，有抑制 | |
2 复孔 Ct≥40 或扩增曲线无明显起峰 | 2 复孔 Ct<40>且有效的“S”型扩增 | 阴性 |
2 复孔 Ct≥40 或扩增曲线无明显起峰 | 阴阳性无法判断，有抑制 |
* VIC 信号如果有抑制，需重测或对样品进行合适处理消除抑制因子。
生效日期：2023 年 05 月 29 日
