本试剂盒适用于 10⁷ 及以下细胞基质中 DNA 病毒、RNA 病毒的核酸提取，又适用于病毒收获液（上清液）的核酸提取。本试剂盒搭配 rHCDpurify ^® 可实现样品的自动处理，操作方便快捷。

n  试剂盒简介

SHENTEK®病毒核酸提取试剂盒适用于 107 及以下细胞基质中 DNA 病毒、RNA 病毒的核酸提取，又适用于病毒收获液（上清液）的核酸提取。本试剂盒搭配 rHCDpurify ®可实现样品的自动处理，操作方便快捷。

细胞基质下的提取方法根据病毒复制场所的不同，将提取方法分为两类：① 复制过程发生在宿主细胞核的病毒及逆转录病毒科病毒，如：RCL/RCR 和大多数的 DNA 病毒（rcAAV/rAAV），采取细胞裂解后全提的方式可降低漏检的风险；② 对于复制过程只发生在宿主细胞质的病毒，如：大多数的 RNA 病毒，采用细胞裂解后离心取上清液提取的方法即可达到检测目的。其中方法①也适用于对样品中未知外源病毒因子的核酸提取，降低漏检的风险。

n  试剂盒组分

n  规格

50 Extractions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 无水乙醇（分析纯）

Ø 100%异丙醇（分析纯）

Ø 1.5 mL 低吸附离心管

Ø 全能核酸酶及其缓冲液（或 100 mM MgCl2）

Ø RNA 酶抑制剂

Ø DEPC 水（针对 RNA 病毒）

n  相关设备

Ø 迷你离心机

Ø 磁性分离架或 rDNApurify ®HCD 前处理系统

Ø 涡旋震荡器

Ø 恒温金属浴或水浴

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液器

Ø 超净台或生物安全柜

Ø 高速离心机

n  操作流程

（一） 细胞基质下病毒核酸的提取流程

（二） 病毒收获液（上清液）的核酸提取流程

n  实验准备

使用试剂盒前需完成以下工作：

Ø  在新开启的洗涤液 A 中加入 20 mL 的无水乙醇。

Ø  在干净的试剂瓶中用无水乙醇和灭菌超纯水或 DEPC 水（针对 RNA 病毒）配制70%乙醇溶液 35 mL，标记为洗涤液 B。配制后的洗涤液应密封，防止乙醇挥发，室温保存。

Ø  准备好 100% 的异丙醇。

Ø  若发现结合液或蛋白酶 K 缓冲液出现结晶或沉淀，应 37 ℃水浴，待沉淀完全溶解后，震荡混匀再用。

Ø  准备好 2 个金属浴或水浴温度，37 ℃和 55 ℃（手工提取还需再准备一个 70 ℃金属浴或水浴）。

Ø  根据样品数量取适量助沉剂Ⅰ用 RNase-Free H2O 稀释 100 倍配成工作液备用。

n  样品准备

Ø  样品平行处理：为了确保结果的准确性，建议每个样品平行进行两次提取和检测。

Ø  阴性对照（NCS）：每次实验中都需要设置一个 NCS 作为空白样品，NCS 与其他待测样品一起进行处理，以检验在样品处理过程中是否存在交叉污染或环境污染。

Ø  若为细胞基质样品需先对细胞进行计数，细胞总数不可超过 107。

Ø  若样品为 RNA 病毒或未知病毒需在待测样品中加入终浓度为 1 U/μL 的 RNA 酶抑制剂，涡旋震荡 10 s，快速离心 3-5 s 后备用。

Ø  rDNApurify ®HCD 前处理系统要求样品体积不超过 300 μL。

n  操作过程

（一）细胞基质下病毒核酸的提取

1.    细胞裂解

在待测样品（107 细胞及以下）中加入 1/10 液体体积的样品处理液，涡旋震荡 10 s，快速离心 3-5 s，室温裂解 5 min。

a.    方法 1（针对细胞核复制的病毒或未知病毒） 2a. 全能核酸酶处理

加入总量为 100 U 的全能核酸酶及其缓冲液（也可用 100 mM MgCl2 代替缓冲液，此时 MgCl2 的终浓度为 2 mM 左右），涡旋震荡 10 s，快速离心 3-5 s，37 ℃处理 30 min。

b.    方法 2（针对细胞质复制的病毒） 2b. 离心取上清

450 g 离心 30 min，弃细胞沉淀取上清进行下一步核酸提取。

2.    样品消化

Ø  加入 100 μL 的蛋白酶 K 缓冲液和 50 μL 蛋白酶 K，涡旋震荡 10 s，快速离心 3-5 s，55 ℃ 孵育 30 min。加入 10 μL 的 5 M NaCl 和 10 μL 的助沉剂Ⅰ工作液（即配即用）涡旋震荡 10 s，快速离心 3-5 s。

•  助沉剂Ⅰ工作液为助沉剂Ⅰ原液用 RNase-Free H2O 稀释 100 倍所得。

•  此步骤结束后可根据实际情况选择机提或手提，其中 rDNApurify ®HCD 前处理系统要求以上待提取的液体体积不超过 500 μL。

3.    手工提取

 （1）  结合

1)        将磁珠置于室温环境下 10 min，振荡混匀。  磁珠可以根据实验量提前进行分装，避免环境温度反复导致结合能力降低。

2)        从水浴中取出样品，快速离心 30 s，加入 200 μL 结合液，振荡混匀。

3)        快速离心 10 s 后在样品混合物中分别加入 200 μL 异丙醇，30 μL 磁珠。

 ·如果样品较多，每次加入磁珠过程中应再次充分振荡磁珠混匀，以保证每次加入的磁珠量的一致性。

4)        将装有全部混合物的离心管置于漩涡振荡器上涡旋震荡 1 min，快速离心 3-5 s,

此步骤重复 4-5 次。静置于磁性分离架上。

5)        待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清。  

·等待磁珠完全分离的时间约为 3-5 min。

·去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。

（2）  洗涤

1)        从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入 700 μL 洗涤液 A，振荡 10 s 使磁珠和洗涤液 A 混匀；快速离心 10 s 后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 1 次磁珠洗涤。

2)        从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入 700 μL 洗涤液 B，振荡 40 s 使磁珠和洗涤液 B 混匀；快速离心 10 s 后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 2 次磁珠洗涤。

3)        为保证液体充分移除，可将离心管再次快速离心 10 s，置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，用 10 μL 枪头小心的将残余液体吸除干净。

 ·去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。

4)        从磁性分离架上取下离心管，打开管盖在室温下干燥 3 min，除去残留的乙醇。  

·干燥时间依具体情况而定，室温较高或空气干燥的环境下可以选择较短干燥时间；

而室温较低或空气湿润环境下，干燥时间可以稍长。

 （3）  洗脱

1)        沿离心管壁加入 50-100 μL 预热的洗脱液 RNase-Free H2O，用漩涡振荡器轻微振荡 5 s 使磁珠和洗脱液 RNase-Free H2O 混匀，70 ℃水浴 7 min，水浴过程中可再次振荡混匀 2-3 次。

 ·振荡后需将残留于管壁上的磁珠和洗脱液轻甩至管底。

 ·振荡至管盖上的磁珠和洗脱液需快速离心后重新振荡混匀。

2)        孵育完成后，将离心管快速离心 1 min，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中。

3)        将上一步获得的离心管快速离心 10 s，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头再次转移溶液到干净离心管，所得即为样品纯化液。

 ·收集洗脱液时，应将离心管内溶液转移完全，离心管内不得残留液体，否则将影响样品检测的准确性。

注意要点

Ø  建议将实验室内部进行分区，分为阴性区（PCR 试剂的配制）、阳性区（样品操作）、扩增区等，做好明显的标识。每个区域配备独立的设备、试剂及耗材，不得交叉使用。实验试剂、待测样品、PCR 产物应分开存放，不应放于同处。减少在实验区内不必要的走动，以降低污染发生概率。

Ø  装有试剂的离心管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或移液枪的风险；谨慎开关反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。

Ø  实验开始前确保实验室环境温度不低于 22 ℃。

Ø  在磁性分离架上分离磁珠时，过程中可缓慢旋转离心管，加速磁珠聚集。

Ø  DNA 洗涤和洗脱操作时，每次振荡混匀后，都应该瞬时离心，以保证没有磁珠或液体附着于离心管盖或管壁上。

Ø  在去除乙醇干燥时，观察磁珠状态，勿让磁珠太干，以免洗脱时不完全溶解。请尽量在完成样品纯化处理当天进行后续的 DNA 检测，以保证检测结果的准确性。

4.    机提的方法：

（1） 按照表 2 在 96 深孔板排布预先加入相应溶液，其中：

第 1 或 7 列：结合液 200 μL/孔，异丙醇 200 μL/孔以及步骤 3 的全部样品

第 2 或 8 列：洗涤液 A 700 μL/孔

第 3 或 9 列：洗涤液 B 700 μL/孔

第 4 或 10 列：磁珠 30 μL/孔

第 5 或 11 列：洗脱液RNase-Free H2O 50-100 μL/孔

 ·磁珠使用前先置于室温环境下 10 min，振荡混匀。

 ·磁珠可以根据实验量提前进行分装，避免环境温度反复导致结合能力降低。  

·步骤 5 的样品可在其他试剂全部加完后再加。样品体积最大为 500 μL/孔。

（2） 程序启动

1)        电源键打开—点击“登录”输入账号及密码—进入主界面。

2)        75%酒精棉球擦拭仪器内壁—点击“紫外灯”—选择“15 min”灭菌。  此步骤可在提取准备操作之前进行。

3)        将加好样的 96 深孔板放入仪器中固定位置，并把塑料套管插入磁头对应位置。

4)        点击“运行”—选择“Virus-730 ”程序。

程序结束，发出“滴滴”声，立即取出深孔板，将样品纯化液全部转移到新的离心管内。

注意要点：

Ø  实验开始前确保实验室环境温度不低于 22 ℃。 

Ø  程序启动前，检查 96 深孔板和套管是否固定好。

Ø  仪器工作前及完成后需要紫外灭菌至少 15 min，并使用 75%酒精棉球将仪器内壁擦拭干净。且两次提取实验间隔至少为 30 min。

Ø  程序运行完毕后，需立即取出 96 深孔板并将洗脱液转移至新的离心管。

Ø  建议完成样品纯化处理当天进行后续的 qPCR 检测，确保检测结果准确。

（二）病毒收获液（上清液）的核酸提取

操作步骤同以上步骤 3—步骤 4，可根据实际进行核酸酶处理以去除无蛋白衣壳保护的核酸片段。

生效日期：2023 年 03 月 29 日