本试剂盒既适用于基于细胞培养后对 rcAAV 的 qPCR 检测，也适用于对 rcAAV 的直接 qPCR 检测；试剂盒可同时实现对 rAAV 载体和 rcAAV 浓度快速、灵敏、特异的定量检测。
本试剂盒适用于血清型 rAAV-5/N (N为不同的衣壳血清型)中 rcAAV-5/N*污染率的定量检测；样品类型包括但不限于重组腺相关病毒的原液或终产品以及基于细胞培养法检测 rcAAV 的细胞样品等。
n 试剂盒简介
SHENTEK® rcAAV 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）既适用于基于细胞培养后对 rcAAV的 qPCR 检测，也适用于对 rcAAV 的直接 qPCR 检测；试剂盒中的参考（Reference）基因和靶（Target）基因包含在同一定量参考品中，其中 Target 基因选取 rcAAV 上两个基因的连接序列，检测结果的准确性高于单个基因检测；试剂盒可同时实现对 rAAV 载体和 rcAAV 浓度快速、灵敏、特异的定量检测。
SHENTEK® rcAAV-5/N 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）适用于血清型 rAAV-5/N (N为不同的衣壳血清型)中 rcAAV-5/N*污染率的定量检测；样品类型包括但不限于重组腺相关病毒的原液或终产品以及基于细胞培养法检测 rcAAV 的细胞样品等。
*注意，在使用本试剂盒前请务必确定：
Ø AAV 血清型；
Ø 待检测样品 rAAV 的末端重复序列（ITR）与以下序列匹配。
>rAAV-5/N 的 ITR CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGC AGCTCAAAGAGCTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAAC GAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCA AGCAAGGGGGT
n 试剂盒组分
n 规格
100 Reactions × 2。
n 有效期
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
n 适用机型（包括但不限于）
Ø SHENTEK-96S 定量 PCR 系统
Ø 7500 Real-Time PCR System
Ø CFX96 定量 PCR 系统
Ø Roche 480
n 实验所需但试剂盒中未含材料
Ø 1.5 mL 无菌低吸附离心管
Ø 96 孔 qPCR 板或八联管
Ø 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL RNase Free 低吸附带滤芯枪头
Ø 病毒核酸提取试剂盒（货号：1506730）
n 相关设备
Ø 迷你离心机
Ø 漩涡振荡器
Ø 荧光定量 PCR 仪
Ø 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 移液枪
n 待测样品提取和检测说明
1. 直接 qPCR 法
1.1 待测样品的提取纯化
Ø 重组腺相关病毒的原液或终产品提取前需进行核酸酶处理，以排除无蛋白衣壳保护的核酸片段的干扰，使得直接 qPCR 法的检测结果更准确。
Ø 提取流程如下（具体步骤请参考病毒核酸提取试剂盒说明书）：
1.2 提取纯化液的检测
（ 1 ） 针对 Reference 基因检测时， 需要先将样品纯化液稀释到标曲范围（20-2 ×106 copies/μL）内。
（2）针对 Target 基因检测时，则无需对样品纯化液进行稀释；
例如：已知 rAAV 病毒原液的浓度约为 2E+12VG/mL，那么其样品纯化液可直接用于 Target 基因检测，但应至少稀释 1000 倍后才能用于 Reference 基因检测。
（1） 用病毒载体原液或终产品转染细胞前，可按 1.1 的提取流程进行样品提取纯化，然后单独使用 Reference 基因对 rAAV 的浓度进行测定；
Ø 此时也需要将待测样本的提取纯化液稀释到标曲范围（20-2 ×106 copies/μL）内；
（3） 得到提取纯化液后，再单独使用 Target 基因对 rcAAV 的浓度进行测定。
1．T & R DNA 定量参考品-5 的稀释及标准曲线的制备
1.1. T & R DNA 定量参考品-5 溶液配制：
第一次使用时，将 T & R DNA 定量参考品-5 管子 12000 rpm/min 离心 1 min；
离心后，准确移取 55 μL ddH2O 加至管底，溶解冻干粉。溶解后定量参考品的浓度为标签浓度。为保证冻干粉充分溶解，短时间快速离心 3-5 s，然后轻柔颠倒混匀，如此重复 3 次，复溶后静置 10 min。若长时间放置需重复以上步骤进行混匀操作。
1.2 T & R DNA 定量参考品-5 标准曲线制备：
根据 T & R DNA 定量参考品-5 标签浓度，取适量定量参考品在干净的 1.5 mL 离心管中用 DNA 稀释液将其稀释至 2×108 copies/μL，标记为 ST。
取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6。
用 DNA 稀释液将标记为 ST 的定量参考品溶液进行 10 倍梯度稀释，按表 2 进行稀释操作。
备注：稀释过程中，振荡混匀 5-10 s 后，短时间快速离心 3-5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。
2.1 根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 重复孔/样。
Ø Reference 基因的反应孔数 =（6 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC +1个待测样品数+1 个阴性质控 NCS）× 3
Ø Target 基因的反应孔数 =（6 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC +1 个待测样品数+1 个阴性质控 NCS）× 3
2.2 根据反应孔数计算本次所需的qPCR MIX 总量（含 2-4 孔的损失量，以 2 孔为例）：qPCR MIX =（反应孔数+2）× 10 μL
2.3 各试剂放在冰上或 2-8 ℃条件下融化，并根据表 3 所示加样：
*100×ROX 加量说明：Target 基因的 100×ROX 是否添加以及添加量取决于所用定量 PCR 仪的机型：若为 SHENTEK-96S 定量 PCR 系统、CFX96 定量 PCR 系统、Roche 480 等不以 ROX 为校准荧光的机型可不加；若为 7500 Real-Time PCR System 每反应加 0.04 μL；其他机型可根据经验进行 ROX 添加量的调整。100×ROX 复融后于 2-8 ℃避光保存。
2.4 上述各试剂置于冰上，混匀，按表 4 所示加样：
2.5 可按表 5 进行样品检测排布。
² 该示例表示的是检测 6 个浓度梯度的 Reference 基因标准曲线（ST1-ST6）、Target基因标准曲线（ST1-ST6）、无模板对照 NTC：NTC-Reference/Target、阴性质控 NCS： NCS-Reference/Target、待测样品 1/x S-Reference 和 S-Target。建议每个检测做 3 个重复孔。
² 实际检测时可根据样品多少，参照表 5 示例进行 96 孔板排版加样。
² 1/x S-Reference 中 x 指稀释倍数，稀释原则为：稀释后的提取纯化液需处在标曲范围（20-2 ×106 copies/μL）内。
将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪，接着进行 qPCR 程序设置：
创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。两组 qPCR MIX 创建新检测探针，分别为命名为 Target-5，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none（如有）；创建新检测探针，命名为 Reference-5，选择报告荧光基团为 CY5，猝灭荧光基团为 none（如有）；检测参比荧光为 ROX（如需）。
4. qPCR 结果分析
4.1待测样品 Reference 和 Target 基因浓度的获取
² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
在“孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。
标准曲线孔的样品类型一栏设置为标准品，根据表在属性一栏分别赋值，设为 2 e+006、2 e+005、2 e+004、2 e+003、2 e+002、2 e+001（含义为每孔的模板浓度，单位为 copies/μL），并且在相应的样品名称一栏中命名为 Target-5 或 Reference-5。
将无模板对照 NTC 孔的样品类型设置为无模板对照，将阴性质控 NCS 孔和待测样品孔的样品类型设置为待测样品，并且在相应的样品名称一栏中命名为 NCS-Reference、 NCS-Target、1/x S-Reference、S-Target。
选择步骤 2：选择项目中的“rcAAV-5/N 检测”程序。
“实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
在实验分析的标准曲线面板中，可读取各标准曲线的斜率、截距、相关系数和扩增效率。
在实验分析的反应孔信息表面板中，浓度和平均浓度一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 copies/μL。通过稀释倍数回算出待测样品的实际浓度。
² 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。
在 Results 的 Amplification Plot 中，将 Reference-5 基因的 Threshold 设置为 0.06， Target-5 基因的 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
在Results 的Plate 中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity一栏分别根据表 2 赋值，设为 2 e+006、2 e+005、2 e+004、2 e+003、2 e+002、2 e+001 （单位为 copies/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 Target-5 或 Reference-5。
在 Results 的 Plate 中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔和待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NCS-Reference、NCS-Target、1/x S1-Reference、S-Target 之后点击 。
在 Results 的 Standard Curve 中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
在 Results 的 Report 中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控NCS 孔和待测样品的检测值，单位为 copies/μL。通过稀释倍数回算出待测样品的实际浓度。
注：上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
4. 2 结果分析
无模板对照 NTC 的 Ct Reference 值和 Ct Target 值应≥35 或 Undetermined。
NCS 的 Ct Reference 值和 Ct Target 值应≥35 或 Undetermined。
根据分析软件给出的待测样品各检测点的浓度（copies/μL），通过稀释倍数回算出待测样品的实际浓度。
Ø 根据以下公式计算 rAAV 中 rcAAV 的污染率：
注：每个 rAAV 含有两个 Reference 基因
修订日期：2024 年 11 月 06 日
生效日期：2024 年 11 月 11 日
400-829-0116
