本剂盒利用线粒体基因细胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）和细胞色素 B（Cyt B）以及细胞色素氧化酶Ⅱ（COⅡ）作为生物制品生产过程中常用 10 种细胞系的分子鉴定靶标。通过多重 PCR 技术可以根据给定的 10 组引物是否存在 PCR 扩增以及 PCR 扩增子的大小进行物种鉴定和交叉污染检测。
n 试剂盒简介
WHO、FDA、欧洲药典及中国药典都规定了对于生产用细胞应进行细胞鉴别检查，以确认细胞系的起源，检测是否存在其他细胞系的污染。SHENTEK®细胞种属鉴别检测试剂盒利用线粒体基因细胞色素氧化酶 I（CO I）和细胞色素 B（Cyt B）以及细胞色素氧化 II（CO II）作为生物制品生产常用的细胞系的分子鉴定靶标，使用混合引物对靶基因进行扩增，通过多重 PCR 联合琼脂糖凝胶电泳技术，根据扩增子的数量和条带大小进行物种鉴定和交叉污染检测。经验证交叉污染检测限可达到 1%及以下，可在同一个反应中同时检测猪、人、猫、中国仓鼠、恒河猴、非洲绿猴、大鼠、狗、小鼠和牛 10 个物种。
本试剂盒所鉴别检测的 10 种细胞种属分别为：Bos taurus （牛）/ Mus musculus （小鼠） / Canis familiaris （狗）/ Rattus norvegicus （大鼠）/ Cercopithecus aethiops （非洲绿猴）/ Macaca mulatta （恒河猴）/ Cricetulus griseus （中国仓鼠）/ Felis catus （猫）/ Homo sapiens （人）/ Sus scrofa （猪）。
n 试剂盒组分
表 1.试剂盒组分
Ø 博日 TC-EA 基因扩增仪
Ø 其他经过适用性验证的 PCR 扩增仪（包含定量 PCR 仪和普通 PCR 仪）
Ø 八联管及其管盖
Ø 1.5 mL 无菌低吸附离心管
Ø 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL RNase Free 低吸附带滤芯枪头
Ø 核酸染料
Ø 6×Loading Buffer (HZSKBio,1801942）
Ø 10×TBE Buffer (HZSKBio,1801943)
Ø PBS 溶液（无菌）
Ø 琼脂糖
Ø 迷你离心机
Ø 漩涡振荡器
Ø PCR 仪
Ø 恒温金属浴
Ø 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 移液枪
Ø 高速离心机
Ø 水平电泳槽（包含梳子、托盘、制胶器）
Ø 锥形瓶、量筒等制胶用具
Ø 电泳仪电源
Ø 凝胶成像仪
Ø 微波炉
图 1 试剂盒操作流程示意图
注意：Ø初次使用本试剂盒实验时需要注意仪器的适用性的验证，包括 PCR 仪的程序设定和水平核酸电泳条件。具体验证方案请参考本试剂盒的使用指南。
取 5E+05 个（细胞总数）新鲜培养的待测细胞置于 1.5 mL 离心管中，113g（约 1000rpm）离心 5 分钟尽可能弃掉培养基，在细胞沉淀中加 500 μL PBS 溶液轻微振荡重悬，16260 g（约 12000rpm）离心 2 分钟尽可能将上清弃净。
注意：
Ø此步骤结束后需立即进行下一步，如果时间不允许需将样品置于-65 ℃及以下保存。
Ø-65 ℃及以下保存前需进行以下操作： 以上细胞沉淀用 PBS 洗一遍后， 113g（约 1000rpm）离心 5 分钟尽可能将上清弃净，液氮速冻 10-30 秒后置于-65 ℃及以下条件保存，建议保存时间不要超过一年。
在每管待测样品中分别加入 100 μL Cell Extraction Buffer，立刻涡旋震荡混匀，之后置于 60 ℃的金属浴中处理 1 小时，接着 95 ℃处理 10 分钟，冷却至室温后直接作为后续 PCR 扩增的模板备用，存储温度-18 ℃及以下。
注意：Ø制备好的样品-18 ℃及以下保存时间不要超过 1 个月，避免反复冻融。
阴性质控 NCS 样品：100 μL Cell Extraction Buffer，提取步骤同上样品处理。
为了避免污染，此步骤需要对实验环境进行阴性和阳性区间的划分。
使用前取 18 μL DEPC 水至 1 个新的 1.5 mL 离心管中，加入 2 μL DNA Sizing Templates MIX，充分混匀后配成 DNA Sizing Templates MIX 工作液备用。
(1) 根据待测样品数量计算所需反应孔数：
反应孔数 = 1 个无模板对照NTC+待测样品数+1 个阴性质控NCS+1 个阳性质控（DNA Sizing Ladder）
注意：ØDNA Sizing Ladder 是以 DNA Sizing Templates MIX 工作液为模板扩增的。
(2) 根据反应孔数计算本次所需的 PCR MIX 总量（含有 1 孔的损失量）：PCR MIX =（ 反应孔数+1）× 17 μL
(3) 各试剂放在冰上或 2-8 ℃条件下融化，并根据表 2 所示配制 PCR MIX：表 2. PCR MIX 配制表
将PCR MIX 充分混匀后按照 17 μL/管分装至 8 联管中，然后按表 3 所示进行加样：
表 3.各反应孔加样示例
注意：
Ø加样完成后每孔总体积为 25 μL，各区域间应避免交叉污染。
ØDNA Sizing Templates MIX 的工作液是 DNA Sizing Templates MIX 母液用DEPC 水稀释 10 倍所得。
注意：
Ø反应程序步骤 2-4 的循环数可以根据实际情况进行调整，初次测试推荐使用 28 个循环。
Ø反应程序的步骤 6，若 PCR 仪器无法设置，需要在程序结束后尽快取出，以防 PCR 扩增产物降解。
1. 制胶:
检测所用的琼脂糖凝胶比例为 2%，具体计算公式如下：
2%凝胶 （w/v）=（琼脂糖 g / 1×TBE 缓冲液 mL）× 100% + 适量核酸染料
注意：ØTBE 的工作液浓度为 1×，配制工作液前请仔细观察母液 10×TBE 是否有沉淀析出，若有析出请水浴加热（37℃）至沉淀完全消失。
Ø 核酸染料加入量请参照其产品说明书。
Ø 制胶所用梳子规格：1.5mm，25 齿/120mm；托盘规格：长度至少为 60mm。
PCR 扩增产物中需加入终浓度为 1×Loading Buffer，上样量推荐 6-10 μL，用 DL500 Marker 作为标记，80-110 V 恒压跑电泳，至溴酚蓝条带跑至接近凝胶 (胶的长度约为 60mm) 边缘处暂停电泳，使用凝胶成像仪分析电泳结果。
注意： ØPCR 扩增产物开盖时，动作要轻柔避免扩增产物飞溅造成的交叉污染。
Ø 只能在电泳间进行开盖操作，电泳间应与扩增间以及 PCR 反应液制备间严格区分，避免交叉污染。
Ø PCR 扩增产物开盖点样后，若所用管子为 8 联管（管子与盖子是分离的），为了避免交叉污染建议使用新的管盖进行重新盖管。
凝胶成像仪以 Geno Sens 2200 为例，相机设置：分辨率：超高，曝光强度：700 ms；显示设置：缩放为 fit, Low 200，High 65535。
注意：Ø凝胶成像仪不同其参数设置也尽不同，但参数调整的原则一致。调整原则为：若结果显示 DNA Sizing Ladder 10 条条带清晰可见（如图 2 泳道 11 所示），则说明电泳条件和凝胶成像仪参数合适，反之则需要继续调整或重新电泳。
图 2：SHENTEK®细胞种属鉴别检测 PCR 产物电泳图（图片为反色呈现）
注：泳道 1-10 是单一细胞系为模板的 PCR 扩增子；泳道 11 是以 10 种细胞系为模板 PCR 扩增产物电泳分布。
(1) 无模板对照 NTC 和阴性质控 NCS 应无扩增条带检出；
(2) 质控品 DNA Sizing Ladder 的凝胶电泳图应与图 2 泳道 11 分布一致，且 10 个条带清晰可见；
(3) 若待测样品的扩增子只有一条带，且大小与目标细胞种属的扩增子条带大小一致（目标细胞种属扩增子条带大小分布参考图 2），则该样品判定为无污染；
(4) 若待测样品扩增子的电泳图出现两条或两条以上的电泳条带，且条带大小能与图 2 所示 10 个细胞种属的条带大小对应，则说明该样品存在其他种属污染，其污染种属可凭扩增子的大小推断（牛 93 bp、小鼠 147 bp、犬 172 bp、大鼠 200 bp、非洲绿猴 256 bp、恒河猴 287 bp、中国仓鼠 315 bp、猫 355 bp、人 394 bp、猪 464 bp）。
(5) 为了结果的可靠性，建议对待检样品进行两次独立重复测试。
(6) 如果遇见异常情况请联系我司技术支持。
修订日期：2023 年 05 月 21 日
生效日期：2023 年 05 月 23 日
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