本试剂盒基于固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的方式对待测样品中hIL-6 的含量进行定量检测。

 产品名称

人白介素-6（Human IL-6）检测试剂盒（酶联免疫吸附法）

 包装规格

96 测试/盒

 预期用途

人白介素-6（Human IL-6）检测试剂盒（酶联免疫吸附法）适用于生物制品中细

胞因子人白介素-6（Human IL-6，hIL-6）的定量检测，例如细胞培养上清、血清等。

 检测原理

本试剂盒基于固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的方式对待测样品中hIL-6 的含量进行定量检测。该分析方法首先通过在预包被抗hIL-6 鼠源单克隆抗体的酶标板中加入校准品或待测样品以捕获溶液中的hIL-6，其次加入另一生物素标记的抗hIL-6 鼠源嵌合单克隆抗体以形成夹心检测结构，随后加入链霉亲和素-辣根过氧化物复合物以放大检测信号；洗涤后，加入TMB 底物进行显色反应，最后使用终止液终止酶催化反应。利用酶标仪在450nm 波长下测读吸光度，其吸光度与校准品或待测样品中的hIL-6 的含量成正相关，通过校准品拟合的剂量-反应曲线即可计算得出待测样品中hIL-6 的含量。本试剂盒对待测样品无需进行特殊处理，仅需通过合适的稀释比例进行适用性验证即可直接使用。本试剂盒操作简单，快速，检测专一性强，性能稳定可靠。

试剂盒组分

储存条件及有效期

未开封试剂盒置2-8 ℃保存，有效期为12 个月。开封组分的保存要求如下：

实验所需但试剂盒中未含材料

 稀释用无菌离心管

 移液器配套用枪头

 拍干酶标板用吸水纸

 加样槽

相关设备

 酶标仪（能够检测450 nm 和620-650 nm 区间内单一波长的吸光度值）

 单道或多道的微量移液器

 微孔板恒温振荡器

 恒温箱（可选）

洗板机（可选）

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备

1. 将试剂盒取出，在使用前于室温平衡约20 分钟。在使用后立即放回2-8 ℃保存。

2. 根据检测样品数量计算所需孔数，取出相应数量的预包被酶标板条，剩余板条连同干燥剂置于自封袋中密封，放回试剂盒中，保存在 2-8 ℃冰箱，于效期内使用完。

备注：室温指25 ℃ ± 3 ℃。

（二） 试剂配制

1. 人白介素-6 校准品溶解：精确量取校准品复溶液500 μL，溶解后轻柔颠倒混匀，静置 5-10 min，得到复溶校准品。根据标签信息计算复溶校准品浓度后进行梯度稀释。

备注：校准品溶解后，酌量分装、保存于-18 ℃及以下，避免反复冻融。

2.1×缓冲液配制：浓缩缓冲液（10×）用超纯水稀释10 倍，例如取25 mL 浓缩缓冲液（10×）加入225 mL 超纯水混匀，即为1×缓冲液，用于洗板。建

用于洗板。建议现配现用。若因采用洗板机洗涤而导致1×缓冲液试剂量不足，可单独采购相同产品号的缓冲液。

备注：取出浓缩缓冲液（10×）和稀释液观察，如有结晶属正常现象，于37 ℃温育直至完全溶解。

3.1×生物素偶联抗人白介素-6 抗体溶液配制：用稀释液于无菌离心管中将生物素偶联抗人白介素-6 抗体（200×）稀释200 倍，轻轻颠倒混匀，即为1× 生物素偶联抗人白介素-6 抗体溶液。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。配制后当天使用。

4. 1×链霉亲和素HRP 复合物溶液配制：用稀释液于无菌离心管中将链霉亲和素HRP 复合物（100×）稀释100 倍，轻轻颠倒混匀，即为1×链霉亲和素HRP 复合物溶液。配制合适体积，以保证加液时有充足的余量。配制后当天使用。

5.校准曲线配制：参照图3 和表3 对校准品进行梯度稀释。

二、样品准备

样品：包括上游表达、下游纯化过程样品及原液、成品制剂等。样品应清澈透明，经离心或过滤等方式去除不溶物。

 处理：待测样品根据其预估所含 hIL-6 的浓度，用稀释液稀释适当倍数，使其检测值落入校准曲线定量范围之中。建议样品稀释倍数选择10 倍以上，保证稀释液发挥正常效应。

 对初次使用或样品中hIL-6 含量未知的情况，强烈建议进行样品适用性验证，确定适宜的样品稀释倍数，以便更好地进行后续常规检测。

备注：相关验证方案可咨询我司技术支持。

三、操作步骤

（一）孵育：校准品及待测样品

1.准确移取100 μL 系列校准品溶液、稀释液（NCS）、待测样品加入相应微孔板中。每个浓度建议做2-3 个平行复孔，并记录各浓度孔所在位置。

2.加样完毕后将微孔板用封板膜密封，放置于微孔板恒温振荡器上，室温条件下600 rpm，避光振荡孵育1 h。

（二）孵育：1×生物素偶联抗人白介素-6 抗体

1. 倒去反应液，用1×缓冲液洗板，300 μL/孔，浸泡30 s，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干。重复3 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。本步骤也可由自动洗板机完成。

2.准确移取100 μL 1×生物素偶联抗人白介素-6 抗体溶液至上述微孔板孔底部，勿引入气泡。封板膜密封后，于室温静置孵育45 min。

（三）孵育：1×链霉亲和素HRP 复合物

1. 倒去反应液，用1×缓冲液洗板，300 μL/孔，浸泡30 s，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干。重复3 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。本步骤也可由自动洗板机完成。

2.准确移取100 μL 1×链霉亲和素HRP 复合物溶液至上述微孔板孔底部，勿引入气泡。封板膜密封后，于室温静置孵育30 min。

（四）显色

1. 提前20 min 将TMB 显色液置于室温条件下平衡。

2. 倒去反应液，用1×缓冲液洗板，300 μL/孔，浸泡30 s，迅速甩掉液体，于纸巾上拍干。重复5 次。洗板后的微孔板应立即进行后续操作，不可放置。本步骤也可由自动洗板机完成。

3.准确移取100 μL TMB 显色液至上述微孔板孔底部，勿引入气泡。于室温静置、避光孵育10 min。此步骤勿用封板膜密封。

（五）终止及读数

1．准确移取50 μL 终止液至上述微孔板孔中，加入顺序需同显色液加入顺序一致，加样时吸头应悬空，避免接触微孔板中溶液，勿引入气泡。

2．设定酶标仪波长450 nm 和620-650 nm（620-650 nm 区间内单一波长均可），测定各孔OD 值。测定时不可覆盖封板膜或盖子。读板应于终止完成后10 min 内完成。

四、结果计算与判断

（一）结果计算

1. 各孔OD450 nm 数值需减去各自孔的长波长OD 值。若酶标仪没有配备长波长时，可以省去此步骤。

2.各校准点和样品的OD 值分别减去阴性对照（NCS）的OD 值后，重复孔取均值。

3.分别以校准点浓度值和经步骤（2）处理后的OD 均值作为X 轴和Y 轴参数进行曲线拟合（共7 个点），获得校准曲线方程。建议优先采用四参数拟合。校准曲线的拟合可以使用酶标仪自带的软件。如无，则建议采用专业的校准曲线拟合软件，如Curve Expert，ELISA Calc 等。

4.将样品的OD 均值作为Y 值代入步骤（3）获得的方程，回算X 值计算样品浓度。若样品是经过稀释后进行测试的，则样品终浓度=稀释后测定值×稀释倍数。

（二）结果判断

1. 校准曲线性能：典型校准曲线参数见（三）所述。校准曲线可能因实验人员的差异和环境的变化而有所差别，为正常现象。

2. 样品适用性：根据多个稀释倍数下的样品结果及其在对应稀释倍数下的适宜加标样品计算回收率，并评估其稀释线性，应符合相应法规的方法学验证要求。

3.样品报告结果：对同一样品采用多个稀释倍数进行测试，样品结果采用符合样品适用性的多个稀释倍数下回算的均值。

（三）性能参数

1. 线性范围：2-512 pg/mL，线性相关系数R2≥0.990。

2. LLOQ：2 pg/mL。

3.特异性：与IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ、IFN-β、IL-6Rα、Rat IL-6、Mouse IL-6 无明显交叉反应。

4. 典型校准曲线及其参数

重要事项提醒

试剂盒使用人员需经过培训，合格后方可使用。为了获得满意的检测结果，请您务必事先留意如下几点事项：

所有的试剂配制务必使用无菌一次性的吸头、试管和加样槽等，切勿混用。避免微量移液器吸头连接部分的污染，建议每次实验前后用75%酒精擦拭。规范移液操作，严禁液体倒吸到移液器，或未去掉吸头时横放在桌上。

 校准品和样品的稀释混匀要轻柔充分，勿产生大量泡沫。

 终止液为酸性溶液，在使用中注意眼睛、面部、手和衣服的防护。

 不同批次试剂盒不建议混用。

 配制缓冲液所用水需为无菌水或新鲜制备的超纯水，水温不得超过37℃。

 加样时将样品加于酶标板底部，尽量不接触孔壁。注意不要有气泡，可轻轻晃动混匀。在上机检测前若有气泡存在，需用干净的10 μL 吸头或针头等戳破，注意不要吸走孔内液体，导致结果误差大。

 在孵育反应时需给酶标板覆膜，防止样品蒸发。

 实验开始后，所有的步骤都应该按顺序进行且不可中断，勿让酶标板处于干燥状态，以防止出现过高的背景值或者错误的结果。

 不用的酶标板条需用试剂盒附带的自封铝箔袋避光保存，以免被其他样品污染，导致试剂盒报废。

 校准品配制、样品稀释等务必精确。例如，单步稀释倍数不超过100 倍、样品最少取样量不小于5 μL 等，以减少实验误差对结果判断带来的影响。

 因生物素偶联抗人白介素-6 抗体（200×）、链霉亲和素 HRP 复合物（100×）装量较少，请在使用前快速离心，以防止试剂的污染和损失。

 显色液应是无色透明液体。吸取时务必更换干净的吸头，防止 HRP 污染。如发现已有淡蓝色，请弃用。

由于叠氮钠能抑制 HRP 活性，对检测结果有很大影响，因此样品中不能添加叠氮钠。

常见问题分析

若实验结果出现异常，请及时对未使用的酶标板和试剂进行妥善保管，对显色的酶标板实验结果拍照，保留实验原始数据。联系我司技术支持为您解决问题。

以下常见的异常现象及解决方法供您参考。

参考文献

 YY/T 1183-2010 酶联免疫吸附法检测试剂（盒）。

 USP<1103>Immunological Test Methods - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

 ICH. M10 Bioanalytical Method Validation And Study Sample Analysis

JPEnzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

生效日期：2024 年12 月04 日