本试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中BHK宿主细胞DNA的专用试剂盒。

n  试剂盒简介

SHENTEK® BHK 残留 DNA 检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 BHK 宿主细胞 DNA 的专用试剂盒。

本试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理，定量检测样品中 BHK 残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 BHK DNA 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中 BHK 残留 DNA。

n  试剂盒组分

n  规格

100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

Ø 7500 Real-Time PCR System

Ø LightCycler 480 II

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 1.5 mL 无菌离心管

Ø PCR 八联管或 96 孔 qPCR 板

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

Ø 荧光定量 PCR 仪

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  操作过程

v BHK DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

BHK  DNA  定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 BHK DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL，30 fg/μL。具体操作如下：

1.       将试剂盒中的 BHK DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 s，如此重复 3 次。

2.       取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。

3.       在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 BHK DNA 定量参考品稀释至 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.       在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。

5.       按表 2 依次进行 5 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

v 加标回收质控 ERC 的制备

根据需要设置 ERC 中的 BHK DNA 加标浓度（以制备加 30 pg BHK DNA 量的样品ERC 为例），具体操作如下：

1.    取 100 μL 待测样品加入 1.5 mL 干净的离心管中。

2.    再加入 10 μL ST3，混匀，标记为样品 ERC。

样品 ERC 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成样品 ERC 纯化液。

v 阴性质控 NCS 的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

1．取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。  阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

v qPCR 反应液（qPCR MIX）的准备

1．根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品×2）×3

待测样品×2 是因为我们推荐每个待测样品检测时都应同时做样品 ERC。 

2．根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：  qPCR MIX =（反应孔数+2）× 20 μL

3．各试剂放在冰上或 2-8 ℃条件下融化，并参考表 3 所示准备 qPCR MIX：

v 加样

1.       各试剂置于冰上，轻微振荡混匀按表 4 所示加样：

加样完成后每孔总体积为 30 μL。

该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 BHK 标准曲线、1 个无模板对照 NTC、1个阴性质控样品 NCS、5 个待测样品（S1-S5）及其对应的 ERC 样品（S1 ERC-S5 ERC）。每个检测做 3 个重复孔。

实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.       将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。

v qPCR 程序设置

² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.    点击“实验向导”。

2.    “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3.    选择步骤 2：选择项目中的“BHK 残留 DNA”程序。

4.    “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.    创建新检测探针，命名为 BHK-DNA，选择报告荧光基团为 FAM ，淬灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。

3.    设置两步法反应程序：95 ℃预变性 10 min；95 ℃ 15s，60 ℃ 1 min（读取荧光）， 40 个循环；反应体积 30 μL。

v qPCR 结果分析

²  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.    “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，例如“BHK 残留 DNA”设为 300、30、 3、 0.3、0.03，并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

2.    待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.    在“实验分析”页面点击 ，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.    在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.4 为例。

1.       在 Setup 的 Plate Setup 面板的 Assign Targrts and Samples 模块中，编辑孔板信息。将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 300、30、3、 0.3、0.03（含义为每孔的模板浓度，单位为 pg/μL）；将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown。

2.       在 Analysis 的 Amplification Plot 面板中，将 FAM 信号的 Threshold 设置为 0.02，两种信号均为 Auto Baseline，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。在 View Well Table 中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

3.       在 Analysis 的 Standard Curve 面板中，可读取各标准曲线的斜率（Slope）、截距（Inter）、R2 和扩增效率（Eff%）。

4.       根据待测样品和样品 ERC 的检测结果计算加标回收率， 加标回收率要求在50%-150%之间。

5.       阴性质控 NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。

6.       无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35.00，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。

 上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2023 年 01 月 31 日

生效日期：2023 年 01 月 31 日