产品信息：
• 检测类型：定量检测
• 产品规格：100测试
• 适用样品类型：对各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的HEK293T细胞来源的E1A及SV40LTA DNA进行分析。
• 线性范围：SV40LTA（4.67×101~4.67×106pg/μL；R2≥0.990；扩增效率为97.5%），E1A（4.97×101~4.97×106copies/μL；R2≥0.990；扩增效率为98.3%）
• 样品回收率：50-150%
• LLOQ：Sv40（9.34 copies/μL），E1A（4.97×101 copies/μL）
• 专属性：不受NS0&SP2/0、E.coli、MDCK、毕赤酵母、Vero、Sf9等常见工程细胞基因组DNA的干扰。
• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在30%以内。
• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。
• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96、博日FQD-96A、Roche LightCycler480
产品特点：
• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。
• 灵敏度高：定量限SV40LTA（9.34 copies/μL），E1A（4.97×101 copies/μL），满足实际检测需求。
• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。
• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。
质量保证：
• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。
• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。
SHENTEK® SV40LTA & E1A 残留 DNA 检测试剂盒（2G）用于定量检测生物制品中宿主细胞，如 HEK 293T 细胞，来源的 SV40 LTA 和 E1A 残留 DNA 的专用试剂盒。
本试剂盒利用荧光探针原理，采用多重 qPCR 的方法定量检测样品中 SV40LTA 和 E1A 残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 101 copies/μL。试剂盒配套有 SV40 LTA & E1A 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的 SV40LTA 和 E1A 微量 DNA。
n 规格
100 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统
Ø 7500 Real-Time PCR System
Ø CFX96 定量 PCR 系统
Ø 1.5 mL 无菌低吸附离心管
Ø 96 孔 qPCR 板或八联管
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头
Ø 迷你离心机
Ø 漩涡振荡器
Ø 荧光定量 PCR 仪
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
SV40LTA & E1A 线性化DNA 定量参考品：将线性化 DNA 定量参考品快速离心 15 s，准确移取 55 μL ddH2O 加至管底，溶解冻干粉，浓度为 20 ng/μL。
为保证冻干粉充分溶解，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 s，如此重复 3 次，再静置 10 min 后使用。
SV40LTA & E1A 非线性化 DNA 定量参考品浓度为 12 ng/μL。
通过如下公式换算成拷贝数，得到线性化 SV40LTA 的浓度为 4.67 × 109 copies/μL，线性化 E1A 的浓度为 4.97 × 109 copies/μL； 非线性化 SV40LTA 的浓度为 2.80 × 109 copies/μL，非线性化 E1A 的浓度为 2.98 × 109 copies/μL。
1. 将试剂盒中的SV40LTA & E1A 定量参考品和DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下融化，待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 s，如此重复 3 次。
可根据自身样品结构特性选择线性化或非线性化 DNA 定量参考品配制标曲。
2. 如使用 SV40LTA & E1A 非线性化 DNA 定量参考品，则取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST、ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。如使用 SV40LTA & E1A 线性化 DNA 定量参考品，则取 8 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST，ST0，ST1， ST2，ST3，ST4，ST5，ST6。
3. 在 ST 管中用 DNA 稀释液将 SV40LTA & E1A 定量参考品稀释 10 倍，得到 ST。振荡混匀短时间快速离心 10 s 后，再在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 ST 稀释 10 倍，得到 ST0，振荡混匀后短时间快速离心 10 s。
4. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。
5. 按表 2 依次进行稀释操作。
已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。
若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。
标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
1．取 100 μL 样品基质溶液(或DNA 稀释液)加入 1.5 mL 干净的离心管中标记为阴性质控 NCS。
阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
1. 根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
反应孔数=（各浓度梯度标准曲线+1 个无模板对照 NTC+1 个阴性质控 NCS +待测样品）× 3
2. 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量：
qPCR MIX =（反应孔数+2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）
3. 各试剂放在冰上或 2-8 ℃条件下融化，并根据表 3 所示准备 qPCR MIX：
4. 上述各试剂置于冰上，混匀，按表 4 所示加样：
加样完成后每孔总体积为 30 μL。
该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 SV40 LTA & E1A 标准曲线（ST1-ST5）、1个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样品（S1-S5）。每个检测做 3 个重复孔。
实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
5. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。
² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. 点击“实验向导”。
2. “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。
3. 选择步骤 2：选择项目中的“SV40LTA & E1A 残留 DNA”程序。
4. “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
² 其他定量 PCR 系统程序设置如下：
选择 FAM 检测通道代表 SV40LTA，选择 CY5 检测通道代表 E1A。
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，命名为 SV40LTA-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 E1A-DNA，选择报告荧光基团为 CY5，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。
3. 设置两步法反应程序：95 ℃ 预变性 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min（读取荧光）， 40 个循环；反应体积 30 μL。
² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，例如非线性化 SV40LTA 设为 2.80e+006、 2.80e+005、2.80e+004、2.80e+003、2.80e+002（单位为 copies/μL），并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
2. 待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。
3. 在“实验分析”页面点击
，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。
4. 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 copies/μL。
以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。
1. 在 Results 的 Amplification Plot 中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在 Results 的 Plate 中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity一栏分别根据表 2 赋值，例如非线性化 SV40LTA 设为 2.80e+006、2.80e+005、2.80e+004、 2.80e+003、2.80e+002（单位为 copies/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
3. 在 Results 的 Plate 中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击
。
4. 在 Results 的 Standard Curve 中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、
R2。
5. 在 Results 的 Report 中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 copies/μL。
6. 样品的 Ct-IPC 值与 NCS 的 Ct-IPC 值要求在±1 个 Ct 值范围内，如样品的 Ct-IPC值与 NCS 的 Ct-IPC 值相比明显增大，则表明样本可能有抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。
7. SV40LTA 的 NTC 检测均值应不超过 14.32 copies/μL，E1A 的 NTC 检测均值应不超过 17.79 copies/μL，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
修订日期：2023 年 03 月 06 日
400-829-0116
