产品信息：

• 检测类型：定量检测

• 产品规格：100测试

• 适用样品类型：对狂犬疫苗的中间品、半成品和成品中HEK293/HEK293T细胞来源的E1A DNA残留进行分析。

• 线性范围：4.97E+01~4.97E+06 copies/μL；R2≥0.990；扩增效率为93.8%

• 样品回收率：50-150%

• LLOQ：1.66E+01 copies/μL

• 专属性：不受E.coli、Vero、NS0、MDCK和毕赤酵母等常见工程细胞基因组DNA的干扰。

• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在30%以内。

• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96、博日FQD-96A、Roche LightCycler480、耶拿qTOWER3G

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：定量下限低至1.66E+01 copies/μL，满足实际检测需求。

• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。

n   试剂盒简介

SHENTEK® E1A 残留 DNA 检测试剂盒用于定量检测生物制品中宿主细胞，如HEK293、293T 细胞，来源的 E1A 残留 DNA 的专用试剂盒。

本试剂盒利用荧光探针原理，采用 qPCR 方法定量检测样品中 E1A 残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠。试剂盒配套有 E1A 线性化定量参考品与非线性化定量参考品，供客户针对自己的需求进行选择。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的微量 E1A DNA。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。

n   试剂盒组分

n   规格

100 Reactions。

n   有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n   适用机型（包括但不限于以下机型，使用前需验证检测灵敏度）

1.        SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

2.        7500 Real-Time PCR System

3.        CFX96 定量 PCR 系统

n   实验所需但试剂盒中未含材料

1.        1.5 mL 无菌低吸附离心管

2.        96 孔 qPCR 板或八联管

3.        1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n   相关设备

1.        迷你离心机

2.        漩涡振荡器

3.        1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  实验操作流程

图 1 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.        工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。

3.        将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2~8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

（二）qPCR 反应液准备：

1.        根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3

2.        MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。

MIX 总量 =（反应孔数 + 2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）

3.       qPCR MIX 配制：根据表 2 配制表准备各试剂 qPCR MIX 用量。表 2. qPCR MIX 配制表

二、样品准备

l E1A DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

E1A 线性化 DNA 定量参考品：将 E1A 线性化 DNA 定量参考品快速离心 15秒，准确移取 55 μLddH2O 加至管底，溶解冻干粉。

为保证冻干粉充分溶解，轻弹数下混匀，短时间快速离心 10 秒，如此重复 3次，再静置 10 分钟后使用。

定量参考品浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行稀释，具体操作如下：

1. 将试剂盒中的 DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 秒，如此重复 3 次。

客户可根据自身样品结构特性选择线性化或非线性化 E1A DNA 定量参考品配制标曲。

2. 如使用 E1A 非线性化 DNA 定量参考品，则取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。如使用 E1A 线性化 DNA 定量参考品，则取 8 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST，ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6。

3. 如使用E1A 非线性化DNA 定量参考品，则在 ST0 管中用DNA 稀释液将E1A非线性化 DNA 定量参考品稀释至 2.98×107copies/μL，得到 ST0，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 秒，重复 3 次。如使用 E1A 线性化 DNA 定量参考品，则在 ST 管中用 DNA 稀释液将 E1A 线性化 DNA 定量参考品稀释至 4.97× 108copies/μL，得到 ST，振荡混匀短时间快速离心 3-5 秒，重复 3 次。再在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 ST 稀释 10 倍，得到 ST0，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 秒，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.     在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。

5.     按表 3 依次进行稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。

l 阴性质控 NCS

1．取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。备注：阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

三、操作步骤

（一）加样

1.     上述各试剂置于冰上，轻微震荡混匀，按表 4 所示加样：

如采用线性化参考品，标准曲线应有 6 个浓度梯度。

²  该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 E1A 标准曲线（ST1～ST5）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样品（S1～S5）。每个检测做 3 个重复孔。

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.     将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 秒后放入qPCR仪。

（二）qPCR 程序设置

l  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.         点击“实验向导”。

2.         “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3.        选择步骤 2：选择项目中的“E1A 非线性化残留 DNA”或“E1A 线性化残留 DNA”程序。

4.         “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

l  其他定量 PCR 系统程序设置如下。

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.  创建新检测探针，命名为 E1A-DNA，选择报告荧光基团为 CY5，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。

3.    设置两步法反应程序：

95℃ 预变性 10 分钟；

95℃ 15 秒，60℃ 1 分钟（读取荧光），40 个循环；反应体积 30μL。

四、结果计算与判断

（一）结果计算

l  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.   “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，例如“E1A非线性化残留 DNA”设为 2.98e+006、2.98e+005、2.98e+004、2.98e+003、 2.98e+002（单位为 copies/μL），并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5；若为“E1A 线性化残留 DNA”，设为 4.97e+006、4.97e+0054.97e+004、4.97e+003、4.97e+002、4.97e+001（单位为 copies/μL），并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、 ST3、ST4、ST5、ST6。

2.   待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.   在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.   在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 copies/μL。

l  以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。

1.   在 Results 的 Amplification Plot 中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.   在 Results 的 Plate 中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别根据表 2 赋值，非线性 DNA 标准曲线设为 2.98e+006 、2.98e+005 、2.98e+004 、2.98e+003 、2.98e+002 （单位为copies/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、 ST4、ST5。线性DNA 标准曲线则设为4.97e+006、4.97e+005、4.97e+004、 4.97e+003、4.97e+002、4.97e+001（单位为 copies/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。

3.   在Results 的Plate 中，将无模板对照 NTC 孔的Task 一栏设置为NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击。

4.   在 Results 的 Standard Curve 中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2 。

5.   在 Results 的 Report 中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 copies/μL。

（二）结果判断

1.   样品的 Ct-IPC 值与 NCS 的 Ct-IPC 值要求在±1 个 Ct 值范围内。如样品的 Ct-IPC 值与 NCS 的 Ct-IPC 值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。

2.   NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35。NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。

结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2023 年 06 月 19 日

生效日期：2023 年 06 月 21 日